bacteri

جدول آزمایش MPN

جدول آزمایش MPN

آزمایش MPN

نتایج بررسی آزمایشات گروه ها

آزمایش MPNآزمون تاییدی

آزمایش MPN:

تعداد احتمالی	0.1 میلی لیتر	1 میلی لیتر	10 میلی لیتر	گروه ها
150	1	2	3	10-8.30
43	0	1	3	11.30-10
44	2	3	2	13-11.30

*از آن جایی تعداد در نمونه 0.1 میلی لیتری گروه 11.30-10 صفر اعلام شد که نمونه ی این گروه موجود نبود و با بررسی های انجام شده پی برده شد که لوله های آزمایش این گروه قبلا توسط اشخاص ناشناسی شسته شده و همان طور که معلوم است، دیگر بررسی برای این نمونه ها وجود ندارد.

آزمون تاییدی:

10-8.30:

A: رشد کلونی ها به شکل صحیحی نبوده است و می توان ذرات کروی ریز تیره و روشنی را مشاهده کرد و تعداد محدودی است.

B: رشد کلونی ها به شکل صحیحی نبوده است و می توان ذرات کروی ریز تیره و روشنی را مشاهده کرد و تعداد محدودی است و در این تعداد کلونی نسبت کلونی های تیره بیشتر از کلونی های روشن است.

C: تعدادی کلونی به رنگ تیره بدون جلای فلزی بر روی سطح کشت دیده می شود و هم چنین تعدادی باکتری به رنگ روشن که نشانگر وجود انتروباکتر ها می باشد و برای بررسی بیشتر، آزمون تاکیدی نیز انجام شود.

D: رشد کلونی ها به شکل صحیحی نبوده است و می توان ذرات کروی ریز تیره و روشنی را مشاهده کرد و تعداد محدودی است و در این تعداد کلونی نسبت کلونی های تیره بیشتر از کلونی های روشن است.

11.30-10:

A: رشد کلونی ها به شکل صحیحی نبوده است و می توان ذرات کروی ریز تیره و روشنی را مشاهده کرد و تعداد محدودی است و در این تعداد کلونی نسبت کلونی های تیره بیشتر از کلونی های روشن است.

B: رشد کلونی ها به شکل صحیحی نبوده است و می توان ذرات کروی ریز تیره و روشنی را مشاهده کرد.

C: رشد کلونی ها به شکل صحیحی نبوده است و می توان ذرات کروی ریز تیره و روشنی را مشاهده کرد.

D: رشد کلونی ها به شکل صحیحی نبوده است و می توان ذرات کروی ریز تیره و روشنی را مشاهده کرد.

13-11.30:

A: پلیت این گروه یافت نشد.

B:سطح پلیت کاملا پوشیده از باکتری می باشد به طوری که جلای فلزی بکتری E.Coli به راحتی قابل مشاهده است و باکتری انتروباکتر نیز در بین کلونی های به هم پیوسته E.coli قابل مشاهده است.

C: سطح پلیت کاملا پوشیده از باکتری می باشد به طوری که جلای فلزی بکتری E.Coli به راحتی قابل مشاهده است و باکتری انتروباکتر نیز در بین کلونی های به هم پیوسته E.coli قابل مشاهده است.

D: در کشت زیگزاگ این پلیت می توان جلای باکتری هغای E.Coli را مشاهده کرد  و کلونی های انتروباکتر نیز قابل مشاهده است.

آزمایش MPN

آزمایش: آزمایش بیشترین تعداد احتمالی و آزمون های آن

هدف: محاسبه بیشترین تعداد احتمالی باکتری ها در یک نمونه ی آبی و به طور کلی بررسی آلودگی آب

به نام خدایی که آغاز همه چیز با او است

مقدمه:

آزمایش MPN (Most Probable Number) روش محاسبه بیشترین تعداد احتمالی باکتری در یک نمونه است، یعنی از طریق این آزمایش می توان تعداد باکتری ها را در سطحی کم محاسبه کرد. در این آزمایش بیشتر برای نمونه های مایع بکار می رود. از جمله مهم ترین کاربرد های آن ر بررسی میکروبی آب است، به طوری کلی آلودگی موجود در آب به شکل های مختلفی و از طریق محیط طبیعی، خاک، مواد دفعی روده ی انسانی یا حیوانی (مدفوعی و از جمله ی مهم ترین این باکتری ها می توان به کلی فرم ها اشاره کرد) وارد آب می شوند. آزمایشات کنترل کیفی برای نظارت بر یک محصول  پس از اتمام روند تولید می باشد و در مبحث  آب و فاضلاب به کلیه آزمون هایی که با آن بتوان کیفیت خواسته شده محصولات اعم از آب و فاضلاب  را نظارت و کنترل نمود اطلاق می گردد. مبحث کنترل کیفیت در سیستم های تولید مبتنی بر مشتری مداری، دارای اهمیت قابل ملاحظه ای است  و نظارت بر روند تولید و کنترل محصول نهایی یکی از ارکان اساسی مرکز مولد کالاست. در جوامع پیشرفته امروزی با توجه به اهمیت سلامت اعضای آن ها تمهیداتی اندیشیده می شود تا آب سالم و بهداشتی در اختیارشان قرار بگیرد و صرف تامین آب برای مشترکین  مطرح نمی باشد.  بدیهی است در این گونه جوامع اتفاقات منجر به آلودگی آب تا حد بسیار زیادی پیشگیری شده و در صورت واقع شدن با انجام آزمایشات مداوم و برنامه ریزی شده به سرعت شناسایی و رفع خواهد شد. شبکه های آب  در حالت ایده آل  شبکه ای ایزوله بدون هیچ گونه راه نفوذ آلودگی می باشد و آزمایشات کنترل کیفی انجام شده برای پایین آمدن ضریب احتمال آلودگی می باشد. در روند انجام آزمایشات قرار بر سلامت آب گذاشته می شود مگر آن که خلاف آن ثابت شود و در صورت مشاهده نتایج منتهی به آلودگی آب سریعاٌ نسبت شناسایی نوع و محل آلودگی اقدام و بایستی رفع آلودگی گردد. از آن جایی نمونه های مایع انتخاب می شود که توزیع یکنواختی از میکروارگانیزم ها را در مایع می توان مشاهده کرد. این آزمایش به دو صورت 3 لوله ای و 5 لوله ای برای بالا بردن سطح دقت آزمایش انجام می شود و هر دو دارای یک روند می باشند.

لازم به ذکر است کلیفرم ها جزو فلور طبیعی روده انسان بوده و مقاوم به املاح صفراوی  و تبدیل کننده لاکتوز به اسید لاکتیک و تولید گاز co₂ در لوله درهام  را باعث می گردد. گروه کلیفرم ها باکتری های هوازی و    بی هوازی اختیاری، گرم منفی، بدون اسپور و میله ای شکل هستند.

بر طبق انجام آزمایش بر روی محیط کشتی لاکتوز براث معرفی این محیط نیز به طور مختصر به شرح ذیل  می باشد.

محیط کشت لاکتوز براث Lactose Broth:

این محیط به منظور استفاده برای تشخیص کلیفرم ها در آب و فاضلاب به کار برده می شود. این محیط از نظر شکل فیزیکی مایع بوده که در لوله های آزمایش تقسیم می شود . پودر حاضر توسط کارخانه سازنده تهیه شده و به بازار عرضه می شود. این محیط در دو غلظت   ضعیف و قوی (13گرم درلیتر و 26 گرم در لیتر) تهیه و مورد استفاده قرار می گیرد. پس از تهیه محیط کشت در غلظت های یاد شده، آن را در لوله های آزمایش بزرگ دورهام دار به مقدار 10 میلی لیتر (قوی) و در لوله های متوسط به مقدار 10 میلی لیتر (ضعیف) تقسیم       می نمایند و پس از مسدود نمودن درب لوله ها با پنبه و در پوش آلومینیومی، آن ها را در ظرف مناسب ( سبد سیمی( قرار داده و در اتوکلاو در درجه حرارت 121 درجه سانتیگراد به مدت 15 دقیقه آن ها را استریل نموده و پس از سرد شدن در یخچال نگهداری می شود. لوله هایی که به این منظور تهیه شده اند، باید طوری انتخاب شوند که پس از ریختن محیط کشت درون آن ها، به مقدار لازم بیش از نصف لوله را اشغال ننماید.

این آزمایش به دو روش غیر مستقیم و مستقیم انجام می شود و تفاوتشان در این است که قبل از قرار دادن حجمی از نمونه ها در محیط کشت، در روش غیر مستقیم ابتدا رقیق سازی نمونه انجام می شود و سپس از آن استفاده می شود.

برای بررسی مثبت بودن این آزمایش عومل زیر را در نتیجه ی آزمایش بررسی می کنیم:

تولید گاز (همان بخارات گازی ایجاد شده در لوله ی درهام)، کدورت (شاخص رشد که از کدر شدن محیط بررسی می شود)، تولید اسید و باز(با استفاده از شناساگر PH مانند کاغذ تورنسل) و هم چنین واکنش های احیایی (استفاده از ترکیباتی مانند متیلن بلو که با جذب الکترون تغییر رنگ را در لوله های آزمایش ایجاد می کند.

آزمون تاییدی:

در این آزمون یکی از آن لوله هایی که واکنش مثبتند را برداشته و یک آنس حلقوی استریل را در نمونه موجود در لوله فرو برده و تکان می دهیم و حال در محیط کشت EMB (ائوزین متیلن بلو) به شکل زیگزاگ یا خطی کشت می دهیم و سپس به مدت 48 ساعت و در دمای 35-37 درجه سانتی گراد در انکوباتور قرار می دهیم. پس از گذشت این زمان نتایج حاصله از آزمایش طبق معیار ذیل گزارش می شود.

کلونی هایی به رنگ تیره (سیاه، سبز تیره) با جلای فلزی نشان گر وجود باکتری E.Coli و در نتیجه تاکید کننده وجود کلی فرم هاست.

کلونی های به رنگ قرمز و یا صورتی نشان گر وجود باکتری انتروباکتر است.

آزمون تاکیدی:

به دنبال آزمون تاییدی آزمون دیگری انجام می شود که این آزمون به علت بررسی رشد میکروارگانیزم های دیگر انجام می شود و طبق روش زیر انجام می شود:

یک محیط کشت LB (لاکتوز براث) برداشته و یک کلونی را از نمونه ی موجود در آزمون تاییدی برداشته و در محیط کشت قرار می دهیم و طبق روش MPN، نتایج حاصله و مثبت بودنشان، نشان گر وجود میکرو ارگانیزم های دیگر است.

آزمون تکمیلی:

این آزمون در مبحث میکروبیولوژی مواد غذایی گنجانده شده است و بر طبق روش زیر می باشد:

برای انجام این آزمایش از تمام لوله های مثبت در آزمایش تاییدی ، نمونه ها را بر روی یک یا چند بشقاب حاوی محیط کشت ENDO یا EMB (ائوزین متیلن بلوآگار) کشت می دهند. سپس محیط کشت داده شده را به مدت 24 ساعت در انکوباتور 35 درجه سانتی گراد قرار می دهند. پس از این مدت کلونی های بدست آمده را مورد مطالعه قرار می دهند .

کلونی هایی که روی محیط کشت ENDO یا EMB رشد کرده اند ، به سه دسته مشخص ، نامشخص و منفی تقسیم میشوند . کلنی های مشخص دارای مرکز سیاه با جلای فلزی میباشند . کلنی های نامشخص به کلنی هایی گفته میشود که بدونه مرگز سیاه ، موکوژی شکل ، غیر شفاف و صورتی رنگ هستند و کلنی های منفی به سایر کلنی های با مشخصات دیگر گفته می شود .سپس از هر بشقاب کشت داده شده ، یک یا چند کلنی مشخص انتخاب نموده و در یک لوله محتوی آبگوشت لاکتوز دار و یک لوله محیط آگار شیب دار کشت میدهند.سپس به مدت 24 یا 48 ساعت در حرارت 35 درجه سانتی گراد قرار می دهند . پیدایش گاز در لوله آگوشت لاکتوز دار ، به منزله مثبت بودن نتیجه آزمایش از نظر کلی فرمهاست . برای تائیید نهایی ، از کلنی های رشد کرده بر روی لوله حاوی آگار شیبدار ، اسلاید تهییه نموده و به روش گرم رنگ آمیزی می نمایند . دیدن باسیل های گرم منفی بدون اسپور دلیل بر وجود کلی فرمها و مثبت بودن نتیجه آزمایش است .

منبع:                                  

www. treatmentprocesses.blogfa.com

www.ehe.blogsky.com

www.ehg.blogfa.com

گزارش کار:

با توجه به آزمایش انجام شده توسط گروه های آزمایشگاهی که به صورت 3 لوله ای می باشد، در این آزمایش نیز به آزمایش 3 لوله ای پرداخته می شود.

آزمایش 3 لوله ای:

ابتدا ثلثی از لوله های آزمایش را از محیط کشت مایع خود (لاکتوز براث) پر کرده و لوله ی درهام را نیز برای مشاهده گاز تولید شده به شکل وارونه در لوله های آزمایش قرار می د هیم و سپس اگر آزمایش به روش غیر مستقیم بود، در سه لوله ی اول رقت ^1-10 و در سه لوله ی دوم رقت ^2-10 و در سه لوله ی باقی مانده رقت ^3-10 را قرار داده و پس از بستن سر لوله ها به وسیله ی پنبه استریل و فویل آلومینیومی، نمونه ها را به مدت 48 ساعت و در دمای 37 درجه سانتی گراد در دستگاه انکوباتور قرار می دهیم. اما در روش مستقیم در سه لوله ی اول 10 میلی لیتر از نمونه و در سه لوله ی دوم 1 میلی لیتر از نمونه و در سه لوله آخر 0.1 میلی لیتر از نمونه را قرار می دهیم و سر آن ها را بسته به همان شکل مرسوم، یعنی استفاده از پنبه و فویل و در انتها نیز آن ها را به مدت 48 ساعت و دمای 37 درجه سانتی گراد در انکوباتور قرار می دهیم.

·     از آن جایی که می خواهیم آزمایش نتیجه ی کاملی به دست بدهد این آزمایش را در مدت 48 ساعت انجام   می دهیم و می توان این آزمایش را در مدت زمان 24 ساعت نیز انجام داد.

·     توجه داشته باشید که این آزمایش را نیز مانند تمام آزمایشات در شرایط استریل و در کنار شعله انجام       می شود.

نتیجه:

MPN:

تعداد احتمالی	0.1 میلی لیتر	1 میلی لیتر	10 میلی لیتر
150	1	2	3

آزمون تاییدی:

تعدادی کلونی به رنگ تیره بدون جلای فلزی بر روی سطح کشت دیده می شود و هم چنین تعدادی باکتری به رنگ روشن که نشانگر وجود انتروباکتر ها می باشد و برای بررسی بیشتر، آزمون تاکیدی نیز انجام شود.

خطای آزمایش:

برداشت اشتباه کلونی در آزمون تاییدی می تواند دلیلی باشد بر این که بکتری به شکل مناسبی رشد نکرده است.

جلسه یازدهم****8/3/90

برخی دیگر از مواد شیمیایی:

الکل ها: یکی از مواد شیمیایی مهم می باشد که برای از بین بردن باکتری ها مورد استفاده قرار می گیرد و در ترکیب با آب، ترکیب بسیار قوی با خاصیت باکتریوسیدالی (میکروب کش) می سازد.

فنول: قدرت میکروب کشی بسیار بالایی دارد و باعث تغییر در ماهیت پروتئین در باکتری می شود. به شکل ترکیب هگزافنول بسیار موثر است، همان طور که در برخی صابون ها استفاده می شود (با استفاده صابون که تغییر در کشش سطحی سطح موجود را شامل می شود و باعث حذف باکتری می شود و نه مرگ باکتری که اگر ترکیب هگزافنول در صابون استفاده شود باعث مرگ باکتری می شود).

هالوژن ها: ید و کلر که جزء ترکیباتی هستند که مطلقا این ترکیبات را باکتریوسین می نامند، یعنی در هر مقدار در مواد غذایی، موجب مرگ باکتری می شوند.

کلر در ترکیب با آب و نمک موجب تشکیل هیپوکلرید سدیم (سفید کننده ها) می شود که خاصیت ضد عفونی کنندگی و باکتری کشی بسیار بالایی دارد.

مهم ترین ترکیبی که از ید ساخته می شود، بتادین است.

*باکتریوسین: به سه دسته ی نایسین مانند لاکتیک اسید باکتری LAB و پیروسین و کلروسین مانند E.Coli تقسیم می شوند.

*پنی سیلین ها و آنتی بیوتیک ها منشا قارچی دارند.

تاکنون مواد شیمیایی بسیاری برای مبارزه با باکتری ها و کاهش فعالیتشان و از بین رفتن آن ها شناسایی و استفاده شده است که طیف وسیعی ای از این مواد، ترکیبات باکتریوسین یا باکتریوکسید هستند. اما کاربرد همه ی مواد شیمیایی  در مواد غذایی برای کاهش فساد میکروبی امکان پذیر نیست.

مواد شیمیایی مورد استفاده در مواد غذایی با خاصیت آنتی باکتریال:

اسید بنزوییک: اولین ماده غذایی که کاربرد آن توسط FDA آمریکا در مواد غذایی بلا مانع اعلام شد و مهم ترین ترکیب اسید بنزوییک پارابن (اسید پارا هیدرکسید بنزوییک) می باشد که کاربرد بالایی دارد، مثلا در باکتری Listeria monoytogues که در گوشت و ماهی و فرآورده های خام وجود دارد را از بین می برد. هم چنین تاثیر اسید بنزوییک تا حد زیادی به PH ماده وابسته است و هر چه PH کمتر باشد، تاثیر آن بیشتر است.

در PH اسیدی، باکتری ها رشد نمی کنند ولی قارچ ها رشد می کنند، بنابراین اسید بنزوییک بیشتر برای مبارزه با قارچ ها استفاده می شود و حد مجاز مصرف آن در مواد غذایی 0.1% می باشد.

اسید سوربیک: به صورت نمک های پتاسیم، سدیم و کلسیم مورد استفاده است و مقدار مجاز آن در مواد غذایی 0.2% می باشد و در 6=PH تاثیر زیادی دارد. در مقابل ترکیباتی از این دست باکتری های هوازی نسبت به   بی هوازی حساس ترند. به طور مثال در باکتری های سالمونلا، کلی فرم ها، استافیلوکوکوس اورئوس (فلور طبیعی پوست و بینی (S.aureus)) تاثیر بیشتری می گذارد. بیشترین کاربرد این ترکیب برای مبارزه با میکروارگانیزم ها در مواد غذایی مانند پنیر، نوشابه و آبمیوه استفاده می شود.

نیتریت و نیترات: به چند منظور در فراورده های غذایی به ویژه فراورده های گوشتی استفاده می شوند و       می توانند به صورت ترکیبات نیترات سدیم و نیتریت سدیم باشند. به منظور تثبیت رنگ قرمز در فراورده های گوشتی استفاده می شوند. در باکتری های هوازی تاثیر بیشتری دارند. در شرایط اسیدی تاثیر گذارترند. بر روی باکتری های LAB، S.aureus و باکتری های رودوی و انتروباکتریاسه ها بی تاثیرند. خواص آنتی باکتریال به ویژه بر علیه کلستریدیوم بوتولینیوم در این ترکیبات وجود دارد و حد مجاز آن ها 50 تا 150 ppm می باشد.

Perigo factor: طی یک تحقیق مشخص شد که وقتی نیتریت قبل از عمل اتوکلاو (در مرحله استریل) به فراورده ها اضافه شود، دارای قدرت از بین برندگی زیادی بر باکتری کلستریدیوم بوتولینیوم دارد ولی اگر نیتریت به فراورده ها بعد از استریل اضافه شود، قدرت از بین برندگی زیادی را نشان نمی دهد که به این خاصیت سینرجیستی نیتریت و حرارت خاصیت Perigo گفته می شود.

در صنایع غذایی برخی عوامل شیمیایی هستند که آن ها اثر غیر مستقیم یک عامل برای از بین بردن میکروب ها تعریف می شوند:

ضد اکسایشی (آنتی اکسیدانی): مهم ترین این ترکیبات BHA و BHT می باشند که برای کاهش اکسایش در   روغن ها استفاده می شوند و غیر از کاربرد اصلی خود، دارای خاصیت ضد باکتریایی نیز می باشند.

اسانس های روغنی برای ایجاد طعم: مثل اسانس آویشن و سیر

آنتی بیوتیک ها و باکتریوسین ها: تفاوت این دو ترکیب از این قرار است که آنتی بیوتیک ها با ورود به بدن تجمع پیدا می کنند اما باکتریوسین ها تجمع نمی یابند و تاثیری بر بدن نمی گذارند. نکات مهمی در مورد کاربرد این ترکیبات وجود دارد:

<!--[if !supportLists]-->·     <!--[endif]-->باید قوی باشند تا فلور میکروبی را از بین ببرند.

<!--[if !supportLists]-->·     <!--[endif]-->در اثر حرارت دهی باید از بین بروند.

<!--[if !supportLists]-->·     <!--[endif]-->باعث تثبیت باکتری های مقاوم به آنتی بیوتیک نشوند.

<!--[if !supportLists]-->·     <!--[endif]-->باید در اندازه ی مجاز در مواد غذایی مصرف شوند.

استفاده از فشار برای کاهش بار میکروبی:

اساس این عمل (عملی هیدرواستاتیک که توسط فشار آب به جسم وارد می شود) ایجاد فشار یکسان و مساوی در همه ی قسمت های ماده ی غذایی است. معمولا در ظروف ایجاد کننده فشار، آب ریخته شده و ماده ی عذایی در داخل آب قرار می گیرد و سپس تحت فشار بسیار زیاد و در حدود 450 تا 800 مگا پاسکال قرار می گیرد. فشار می تواند به صورت ممتد باشد و یا به صورت متناوب که در صورت متناوب بودن دارای تاثیر بیشتری است.

اصولی که در مورد فشار وجود دارد:

<!--[if !supportLists]-->·     <!--[endif]-->موجب ایجاد حرارت نمی شود.

<!--[if !supportLists]-->·     <!--[endif]-->تحت تاثیر فشار، پیوند های کووالانسی تحت تاثیر قرار نمی گیرند و ترکیبات طعم زا از بین نخواهند رفت و در حالت کلی تاثیری بر ماده ی غذایی ندارد.

<!--[if !supportLists]-->·     <!--[endif]-->در فشار بالا در حدود 400 تا 600 مگا پاسکال، پروتئین های باکتری ها تحت تاثیر قرار می گیرد.

<!--[if !supportLists]-->·     <!--[endif]-->در مواد غذایی خشک، فشار تاثیر خیلی زیادی ندارد.

<!--[if !supportLists]-->·     <!--[endif]-->زمانی که فشار به میکروارگانیزم وارد شود، کمپلکس پروتئین و چربی در غشای سیتوپلاسمی به هم می ریزد و به همین دلیل سیتوپلاسم سیال تر شده و احتمال از بین رفتن میکروارگانیزم بیشتر می شود.

<!--[if !supportLists]-->·     <!--[endif]-->در صورتی که از مواد باکتریوسین مثل نایسین برای از بین بردن باکتری ها استفاده شود، فشار می تواند تاثیر بیشتری داشته باشد. (اثری سینرجیستی)

<!--[if !supportLists]-->·     <!--[endif]-->استفاده از فشار خو دارای معایب و مشکلاتی است که از مهم ترین آن ها می توان، نیاز به هزینه ی بسیار بالا برای ساخت تجهیزات فشار اشاره نمود.

<!--[if !supportLists]-->·     <!--[endif]-->میزان جساسیت میکروارگانیزم ها به فشار: گرم منفی < قارچ > گرم مثبت > اسپور باکتری

*برای اسپور باکتری، فشار 800 مگا پاسکال نیاز است تا فرم رویشی آن را از بین ببرد.

سوال هفته 1

سوال هفته:

رنگ آمیزی اسپور؟

رنگ آمیزی اسپور:

اسپورها می توانند در شرایط نامساعد که باکتری ها قادر به تحمل آن نیستند، زنده بمانند. هر باکتری فقط یک اسپور تولید می کند و از هر اسپور هم یک باکتری به وجود می آید. اندوسپور یا اسپور داخلی بیشتر در باکتری ها و اگزوسپور یا اسپور خارجی بیشتر در قارچ ها دیده می شود .دلایل مقاومت اسپور عبارتند از:

- وجود مقدار بسیار کم آب درآن

- وجود ماده ای به نام دی پیکولینات کلسیم در آن

- لایه های مختلف اطراف دیواره ی اسپور

باکتری های اسپوردار عبارتند از : باسیلوس ها، کلستریدیوم ها، کوکسی های گرم به نام اسپوروسارسینا و عامل تب کیو. شکل و محل استقرار اسپور در تشخیص باکتری های اسپوردار کمک می کند. به طوری که اسپور در باسیلوس انتراسیس بیضی شکل و مرکزی، اسپور کلستریدیوم تتانی گرد و انتهایی و اسپور کلستریدیوم بوتولینوم بیضی شکل و نزدیک به انتها می باشد.

روش رنگ آمیزی:

ابتدا بر روی چهار لام، در گوشه لام ها، نام باکتری هایی را که مورد استفاده قرار می گیرند می نویسیم. به وسیله یک لوپ مقداری از باکتری مورد نظر را بر روی لام مورد نظر قرار می دهیم و اجازه می دهیم در دمای اتاق خشک شود و سپس به وسیله حرارت آن را تثبیت می کنیم. روی نمونه لام را با کاغذی که به اندازه لام بریده شده است می پوشانیم و لام را بر روی حمام آب گرم قرار می دهیم، سپس کاغذ روی لام را با مالاشیت گرین آغشته کرده و به آرامی برای مدت زمان پنج دقیقه رنگ را حرارت می دهیم و پس از آن که از آن بخار برخواست پیاپی مالاشیت گرین به آن اضافه می کنیم تا در حین حرارت دهی به میزان کافی از رنگ اشباع شود، اما باید مواظب بود تا سطح لام خشک نشود. پس از آن لام را برداشته و اجازه می دهیم تا سرد شود، سپس با آب برای مدت سی ثانیه شستشو می دهیم. برای مدت زمان ٦٠-٢٠ ثانیه با رنگ زمینه ای سافرانین رنگ آمیزی کرده و پس از آن برای مدت سی ثانیه با آب شستشو می دهیم. سپس سطح لام را با کاغذ خشک کرده و سپس با اضافه کردن روغن در زیر میکروسکوپ با مشاهده می کنیم که اسپورهای آزاد و اندوسپورها به رنگ سبز و سلول ها به رنگ قرمز مشاهده می شوند.

طرز تهیه رنگ ها و محلول ها:

- مالاشیت گرین (محلول 5/.%)

5 گرم مالاشیت گرین را در 100سی سی آب مقطر حل کنید.

- سافرانین (محلول 5/.%)

5/.گرم سافرانین را در 100سی سی آب مقطر حل کنید.

منبع:

www.ls87-zdmu.mihanblog.com

www.oveyssi.blogfa.com

www.azmayeshat.mihanblog.com

سوال هفته

سوال هفته:

تفاوت باکتری های گرم مثبت و گرم منفی به همراه چند مثال از باکتری های صنایع غذایی؟

پاسخ:

تفاوت باکتری های گرم مثبت و گرم منفی:

باکتری ها با روش رنگ آمیزی گرم (Gram stain) به دو دسته تقسیم می شوند. گرم مثبت و گرم منفی که گرچه هر دو باکتری گرم منفی و گرم مثبت دارای دیواره می باشند ولی فرق بین این دو گروه مربوط به خواصی است که در ساختمان دیواره سلولی آن ها و اساسا در پوشش سلولی آن ها وجود دارد. پوشش سلولی گرم مثبت‌ها نسبتاً ساده بوده، از دو تا سه لایه تشکیل شده است:غشای سیتوپلاسمی، یک لایه پپتیدوگلیکان ضخیم و در بعضی باکتری‌ها یک لایه به نام کپسول یا یک لایه S در خارج وجود دارد. هم چنین پوشش سلولی گرم منفی‌ یک ساختمان چند لایه‌ای و بسیار پیچیده می‌باشد . غشای سیتوپلاسمی (در باکتری‌های گرم منفی، غشای داخلی نامیده می‌شود) که به وسیله یک ورقه مسطح از پپتیدوگلیکان پوشیده می‌شود که یک لایه پیچیده به نام غشای خارجی به آن متصل می‌گردد. یک کپسول خارجی یا لایه S نیز ممکن است وجود داشته باشد. فضای بین غشای داخلی و خارجی به نام فضای پری پلاسمیک نامیده می‌شود. به همین دلیل است که در رنگ آمیزی گرم، پس از استفاده از الکل باکتری های گرم منفی رنگ خود را از دست می دهند و برای رنگ بری باکتری های گرم مثبت نیز تنها به زمان بیشتری برای اثر پذیری الکل بر این لایه لازم است.

باکتری های گرم منفی بیشتر از باکتریهای گرم مثبت به دی اکسید کربن حساس تر هستند.

نام چند باکتری گرم مثبت و گرم منفی در صنایع غذایی:

گرم منفی: سودوموناس، کلی فرم ها، سالمونلا، شیگلا، کلسترودیوم بوتولینیوم

گرم مثبت: استرپتوکوکوک، لاکتوباسیل، لاکتیک اسیدها

منابع: 

www.foodtec.ir

www.wikipedia.org

www.iranfoodnews.com

رنگ آمیزی گرم

آزمایش: رنگ آمیزی گرم

هدف: آموزش روش رنگ آمیزی گرم و آشنایی با باکتری های گرم مثبت و منفی و تفکیک آن ها از یکدیگر

به نام خالق یکتای عالم

مقدمه:

رنگ‌آمیزی گرم یکی از مهم ‌ترین و متداولترین روش‌های رنگ آمیزی در میکروبیولوژی است که اولین بار توسط کریستین گرم ابداع شد. در این رنگ آمیزی باکتری‌ها بر مبنای رنگ باکتری پس از رنگ آمیزی به دو دسته گرم مثبت و گرم منفی تقسیم می ‌شوند. رنگ باکتری پس از رنگ آمیزی به توانایی حفظ رنگ اول و به عبارتی به ساختمان دیواره سلولی باکتری بستگی دارد. در رنگ آمیزی گرم باکتری‌های گرم مثبت پس از رنگ آمیزی به رنگ بنفش و باکتری‌های گرم منفی به رنگ قرمز مشاهده می‌شوند. گرچه هر دو گروه یعنی باکتری‌های گرم مثبت و منفی دارای دیواره می‌باشند ولی فرق بین این دو گروه مربوط به خواصی است که در ساختمان دیواره سلولی آن ها وجود دارد. اساس ساختمان در دیواره سلولی باکتری‌های گرم مثبت یک لایه ضخیمی‌ است از پپتیدوگلیکان، ولی در باکتری‌های گرم منفی ضخامت آن به حداقل می‌ رسد.

کاربرد رنگ آمیزی گرم:

از رنگ آمیزی گرم به دو جهت استفاده می ‌شود:

·شناسایی جنس باکتری

·انتخاب آنتی بیوتیک مناسب (باکتری‌های گرم مثبت در مقایسه با باکتری‌های گرم منفی نسبت به پنی سیلین حساسیت بیشتری دارند)

با این حال همه ی باکتری‌ها را نمی‌توان با رنگ آمیزی گرم مشاهده نمود.

گزارش کار:

در روش رنگ آمیزی گرم ابتدا باید گسترش یا اسمیر تهیه نمود و آن را تثبیت کرد که برای این عمل ابتدا یک لام برداشته و آن را با پنبه و الکل ابتدا تمیز کرده و سپس یک قطره آب مقطر یا سرم فیزیولوژی بر روی لام می ریزیم و پس از آن با استفاده از یک آنس استریل یک کلونی برداشته و بر روی آب مقطر موجود بر روی لام قرار داده و پخش می کنیم. حال لام و نمونه را بر روی شعله چهار الی پنج بار گذرانده تا آب و نمونه خشک شود و نمونه ی فیکس شده حاضر شود. سعی شود تا لام بیش از اندازه حرارت نبیند و داغ نشود زیرا موجب از بین رفتن نمونه می شود که برای جلوگیری از این خطا پس از چند بار گذراندن لام از روی شعله، لام را به پشت دست می زنیم و زمانی حرارت مناسب است که دست را نسوزاند.

در مرحله بعد از کریستال ویوله استفاده کرده و چند قطره از آن را بر روی نمونه می ریزیم و به مدت یک دقیقه صبر می کنیم و سپس نمونه را با آب مقطر شستشو می دهیم تا رنگ های اضافی شسته شود. سپس چند قطره از معرف رنگی لوگل را بر روی نمونه می ریزیم و به مدت یک دقیقه صبر می کنیم و حال با استفاده از الکل یا استون رنگ بری را انجام می دهیم. مدت زمان این مرحله 10 ثانیه می باشد.

به موجب تثبیت رنگ توسط کریستال ویوله و لوگل و از بین بردن این عمل، از الکل استفاده می شود. زیرا باکتری های گرم منفی در این مرحله رنگ دیواره ی خود را از دست داده و این رنگ بری زمانی است که الکل، لیپید موجود در دیواره را در خود حل کرده است و هم چنین باکتری های گرم مثبت به همان رنگ ثابت باقی می مانند و اگر بیش از 10 ثانیه شود باکتری های گرم مثبت نیز بدون رنگ می شوند و در آزمایش خطا پیش می آید.

در مرحله بعد با آب مقطر دوباره نمونه را شستشو داده و پس از شستشو از رنگ فوشین یا سافرانین استفاده   می شود و چند قطره از آن را بر روی نمونه ریخته ، به مدت 30 ثانیه که این معرف برای رنگ آمیزی   باکتری های گرم منفی می باشد که در مرحله ی قبلی رنگ خود را از دست داده اند و سپس دوباره نمونه را شستشو داده و حال نمونه را در مجاورت هوا قرار داده تا خشک شود و سپس یک لامل بر روی نمونه         می گذاریم و در زیر میکروسکوپ مشاهده می نماییم که باید در مشاهدات خود، باکتری گرم مثبت را به رنگ بنفش و باکتری گرم منفی را به رنگ قرمز مشاهده کنیم.

·     مراحل این آزمایش را بر روی تشتک رنگ آمیزی انجام دهید.

·     توجه داشته باشید که این آزمایش را نیز مانند تمام آزمایشات در شرایط استریل و در کنار شعله انجام می شود.

نتیجه:

در این آزمایش و رنگ آمیزی باکتری و مشاهده در زیر میکروسکوپ باکتری هایی به رنگ قرمز و بنفش که نمایان گر باکتری های گرم منفی و گرم مثبت است، مشاهده گردید.

خطای آزمایش:

برداشت نادرست کلونی و هم چنین رنگ آمیزی اشتباه و رعایت نکردن زمان های تعیین شده و خصوصا  استفاده ی نادرست الکل می تواند در نتیجه آزمایش تاثیر گذار باشند.

منبع:

www.wikipedia.org