آزمون MPN

آزمون MPN


آزمون IMVIC

بازدید کارگاه (23/9/90)

بازدید کارگاه (23/9/90) درس عملیات کارگاهی
محمودآباد - شهرک صنعتی

آزمون تکمیلی MPN (آزمون IMVIC)

آزمون تکمیلی MPN (آزمون IMVIC):

پس از انجام آزمون تاییدی MPN در صورت واکنش مثبت بودن این آزمون انجام می شود. این آزمون برای تشخیص   کلیفرم ها از انتروباکتر انجام می شود و از 4 تست تشکیل شده است.

تست اول: ایندول (Indole)

در محیط کشت گلوکز پپتون، آمینو اسیدی به نام تریپتوفان وجود دارد که بوسیله ی تولید آنزیم تریپتوفاناز به ایندول تبدیل می شود و توسط معرف کواکس از خود رنگ قرمز نشان می دهد. در صورت ایجاد نشدن تریپتوفاناز، ایندولی تولید نخواهد شد و در این صورت تغییر رنگی هم نخواهد بود.

روش:

·   یک آنس حلقوی استریل را وارد نمونه کشت داده شده ی واکنش مثبت در آزمون MPN (محیط کشت LB) می کنیم.

·   آنس را از LB خارج کرده و در محیط کشت گلوکز پپتون براث وارد کرده و تکان می دهیم.

·   نمونه را در انکوباتور در شرایط دمایی 37 درجه سانتیگراد و به مدت 24 ساعت قرار می دهیم.

·   پس از انکوباسیون چند قطره از معرف کواکس به نمونه اضافه می کنیم و پس از چند لحظه نتیجه ی آزمایش مشخص    می شود.

نتیجه:

·   در صورتی که پس از اضافه کردن معرف کواکس در قسمت بالای محیط کشت حلقه ی قرمز رنگ تشکیل شود واکنش مثبت و در غیر این صورت منفی خواهد بود. نتایج در یک جدول ثبت می شود.

تست دوم: متیل رد (Methyl red)

محیط کشت MRVP دارای گلوکز است که در صورت تخمیر و ایجاد اسید PH آن کمتر از 4/5 خواهد بود که معرف    متیل رد با تاثیر یر شرایط اسیدی آن موجب تغییر رنگ نمونه می شود. در صورتی که تخمیری انجام نشود، اسیدی هم نخواهد بود و معرف متیل رد تاثیری نخواهد داشت.

روش:

·   یک آنس حلقوی استریل را وارد نمونه کشت داده شده ی واکنش مثبت در آزمون MPN (محیط کشت LB) می کنیم.

·   آنس را از LB خارج کرده و در محیط کشت  MRVP Broth وارد کرده و تکان می دهیم.

·   نمونه را در انکوباتور در شرایط دمایی 37 درجه سانتیگراد و به مدت -4824 ساعت قرار می دهیم.

·   پس از انکوباسیون چند قطره از معرف متیل رد به نمونه اضافه می کنیم و پس از چند لحظه نتیجه ی آزمایش مشخص   می شود.

نتیجه:

·   در صورتی که پس از اضافه کردن معرف متیل رد نمونه ی آزمایش به رنگ قرمز تبدیل شود واکنش مثبت و در غیر این صورت و ثابت باقی ماندن رنگ نمونه نتیجه منفی خواهد بود. نتایج در یک جدول ثبت می شود.

تست سوم: وژز پروسکوئر (Vogesproskaure)

در محیط کشت MRVP گلوکز وجود دارد که در صورت تخمیر استوئین (استیل متیل کربونیل) ایجاد می شود که توسط معرف قلیایی VP دی استیل ایجاد شده به رنگ قرمز در می آید و در صورت ایجاد نشدن تخمیر استوئینی ایجاد نمی شود و رنگ قرمزی نیز تشکیل نمی شود.

روش:

·   یک آنس حلقوی استریل را وارد نمونه کشت داده شده ی واکنش مثبت در آزمون MPN (محیط کشت LB) می کنیم.

·   آنس را از LB خارج کرده و در محیط کشت  MRVP Broth وارد کرده و تکان می دهیم.

·   نمونه را در انکوباتور در شرایط دمایی 37 درجه سانتیگراد و به مدت -4824 ساعت قرار می دهیم.

·   پس از انکوباسیون چند قطره از معرف VP (این معرف از دو معرف تشکیل شده است و با هم در نمونه ترکیب می شوند که از 0/6 میلی لیتر معرف آلفانفتول 5 % و 0/2 میلی لیتر معرف پتاس 40 % تشکیل شده است) به نمونه اضافه می کنیم و نمونه را به مدت 10-20 دقیقه در انکوباتور در دمای 37 درجه سانتی گراد قرار می دهیم.

نتیجه:

·   در صورتی که پس از انوکوباسیون پس از اضافه کردن معرف VP در نمونه آزمایش رنگ قرمز مشاهده شود واکنش مثبت و در صورت ایجاد نشدن رنگ قرمز مجددا نمونه را به مدت 30-45 دقیقه در انکوباتور قرار می دهیم و حال اگر رنگ قرمز مشاهده شد، واکنش مثبت است و در غیر این صورت نتیجه ی منفی برای نمونه ثبت می شود. نتایج در یک جدول ثبت می شود.

تست چهارم: سیترات

محیط کشت SC دارای بروموکروزول سبز است که از مصرف سیترات تغییر رنگ را ایجاد می کند.

روش:

·   یک آنس سوزنی استریل را وارد نمونه کشت داده شده ی واکنش مثبت در آزمون MPN (محیط کشت LB) می کنیم.

·   آنس را از LB خارج کرده و در محیط کشت  SC Agar(سیمول سیترات) در یک لوله ی آزمایش به صورت سطح شیب دار می دهیم، به این صورت که آنس را مستقیم وارد نمونه کرده و سپس در همان راستا خارج کرده و بر روی سطح به صورت زیگزاگ کشت می دهیم.

·   نمونه را در انکوباتور در شرایط دمایی 37 درجه سانتیگراد و به مدت 24 ساعت قرار می دهیم.

نتیجه:

·   در صورتی که پس از انوکوباسیون محیط کشت نمونه ی آزمایش دچار تغییر رنگ به آبی شد واکنش مثبت ثبت می باشد و در غیر این صورت و سبز ماندن محیط کشت نتیجه منفی ثبت می شود. نتایج در یک جدول ثبت می شود.

جدول ثبت نتایج:

C	VI	M	I
-	-	+	+	E.coli
+	+	-	-	Entrobacter

« نتیجه ی مشاهده شده توسط این گروه برابر نتایج جدول بالا می باشد و به این صورت حضور کلیفرم ها در نمونه ی آب آزمایش شده تایید می شود»

جلسه ی نهم: 20/9/90

کلر و ترکیبات آن: عمل ضد میکروبی کلر و ترکیبات آن بر اساس عمل قوی اکسید کنندگی و اتصال پروتئین ها می باشدو هر دو واکنش در متابولیسم آنزیمی سلولی میکروب دخالت دارد. عمل کلر با حضور مواد آلیمختل می شود زیرا به طور شیمیایی با آن ترکیب شده و بی اثر می شود. واکنش کلر با آمونیاک و ترکیبات آمونیومی نیز قدرت آن را کاهش می دهد. حرارت به طور قابل ملاحظه ای اثر کلر را افزایش می دهد. اسید هیپوکلریت بیشترین اثر ضد میکروبی را در میان اشکال متلف کلی دارد در PH حدود 5-4 غالب کلر به صورت HClO است. هیپوکلریت ها به عنوان ضد میکرب ارگانیزم هایی مانند ویروس ها، باکتری ها، اسپور باکتری ها، قارچ ها و مخمرها شناخته شده اند. فرم رویشی باکتری ها به کلر حساس تر است. میزان کلر برای نابودی کپک ها 10 برابر بیشتر از میزان کلر برای نابئدی باکتری هاست.

پراکسید هیدروژن (H₂O₂): این ماده ی شیمیایی یک ضد عفونی کننده است تا یک ممانعت کننده، عمل آن پایدار نیست زیرا به محض این که روی ماده ای اثر کرد، تجزیه می شود. عمل ضد میکروبی آن به علت خاصیت اکسید کنندگی آن است و باعث تغییرات برگشت ناپذیر به خصوص در سیستم آنزیمی می شود. اثر نابودکنندگی پرکسید هیدروژن اساسا روی     باکتری هاست. در حالی که مخمرها و کپک ها برای نابودی نیاز به غلظت بالایی از پراکسید هیدروژن دارند. پراکسید هیدروژن برای استریلیزاسیون کاغذ بسته بندی در روش استریلیزاسیون UHT و در مواردی برای نابودی میکروب های شیر مورد استفاده قرار می گیرد. این ترکیب دارای اثرات سوء در مواد غذایی از جمله ایجاد بوی بد در غذا ست که به علت اکسیداسیون مواد غذایی می باشد. هم چنین سبب تخریب ویتامین C می شود.

لیزوزیم: یک آنزیم تجزیه کننده است که در بسیاری از سیستم های طبیعی مانند شیر، تخم مرغ و ... وجود دارد. لیزوزیم باکتری ها را در اتصال β(1-->4) بین N-استیل مورامیک اسید و N-استیل گلوکز آمین لایه ی پپتیدوگلیکان دیواره ی سلولی لیز (تجزیه) می کند. بنابراین باکتری های G- که دارای لایه ی مقاوم لیپو پروتئین و لیپو پلی ساکارید هستند نسبت به این آنزیم از بکتری های G+ مقاوم ترند. البته چنان چه این لایه در باکتری های G- با هر روشی آسیب ببیند، انزیم به لایه ی موکوپپتید (موکو: چسبندگی( نفوذ کرد و باعث لیز کردن کامل یا نسبی دیواره ی سلولی می شود. در بین مواد ضد میکروبی طبیعی شاید لیزوزیم بیشترین کاربرد را دارد و برای جلوگیری از یک فلور نامناسب در کره، شیر و پنیر مثلا جلوگیری از تولید باد کردگی دیررس توسط کلستریدیوم تایروبوتیریکم در پنیر به کار می رود.

کلرید سدیم: قرن ها نمک به عنوان معروف ترین ماده ی نگهدارنده برای گوشت، ماهی و سبزیجات مورد استفاده قرار گرفته است ولی امروزه بیشتر همراه با سایر مواد یا روش های ممانعت کنندگی میکروبی به کار می رود. غلظت نمک لازم برای جلوگیری از رشد میکروبی بستگی به PH، میزان آب، نوع میکروارگانیزم (از نظر هالوفیل یا هالوفوب بودن)، درجه حرارت، ترکیب شیمیایی محصول و حضور سایر مواد نگهدارنده دارد. دلایل متعددی برای جلوگیری از رشد میکروبی توسط نمک های طعام پیشنهاد شده است. اولین دلیل، اثر پلاسمولیتیک است. گرفتن آب، خروج اکسیژن، مداحله با آنزیم ها، تغییر PH و تولید یون های سدیم و کلر در غلظت های بالا که سمی هستند، از دلایل دیگر است.

شکر: مقدار کم شکر به عنوان منبع انرژی توسط بسیاری از میکروارگانیزم ها مصرف می شود ولی مقدار زیاد آن ممکن است روی میکروارگانیزم ها اثر ممانعت کنندگی داشته باشد چرا که ساکاروز باعث کاهش فعالیت آبی می شود. بنابراین عمل ممانعت کنندگی آن بستگی به چگونگی رشد ارگانیزم ها در رطوبت مختلف دارد. مکانیزم اثر نگهدارندگی قند ها از جمله ساکاروز، مشابه نمک است ولی تفاوت در غلظت نسبی مورد استفاده است. طوری که برای اثر مهارکنندگی یکسان، باید غلظت ساکاروز 6 برابر نمک طعام باشد. باکتری ها در برابر میزان ساکاروز از کپک ها و مخمرها حساس ترند.             (اسموفیل ها میکروارگانیزم هایی هستند که قادر به رشد در غلظت های زیاد قندی هستند مثل زیگوساکارومایسس روکسی. هالوفیل ها میکروارگانیزم هایی هستند که قادر به رشد در غلظت های زیاد نمک هستند. اسمودیوریک قادر به رشد در غلظت زیاد قندی نمی باشند اما این غلظت را تحمل می کنند. هالودیوریک قادر به رشد در غلظت زیاد نمک نمی باشند اما این غلظت را تحمل می کنند.)

دی اکسید سولفور و سولفیدها: این ترکیبات وقتی در آب حل می شوند به سه صورت اسیدسولفورو (H₂SO₃)، سولفید هیدروژن (HSO₃) و یون سولفید (SO₃^2-) در تعادل هستند. در PH=1/7 مولکول غالب اسیدسولفورو می باشد. در PH حدود 1/7-5/1 سولفید هیدروژن و در PH بالای 5/1 یون سولفید فرم غالب است. بیشترین عمل ضد میکروبی مربوط به گاز محلول SO₂ و اسید سولفورو تجزیه نشده است بنابراین هر چه PH کم تر باشد قدرت ضد میکروبی افزایش می یابد. اثر ضد میکروبی این ترکیبات بر روی باکتری ها بیش تر از قارچ هاست. از SO₂ و سولفید برای نگهداری میوه و سبزیجات قبل و بعد از خشک کردن، هم چنین در محصولات گوشتی استفاده می شود. لازم به ذکر است که مصرف زیاد این ترکیبات می تواند اثر سمی بر روی انسان داشته باشد.

نیترات و نیتریت: نیترات منحصرا روی باکتری های غیر هوازی اثر ضد میکروبی دارد ولی رشد باکتری های هوازی را تقویت می کند. نیترات در پنیر، شیر و فراورده ای گوشتی مصرف می شود. عمل ضد میکروبی نیترات به تنهایی کم است و با تبدیل به نیتریت خاصیت ضد میکروبی را ایفا می کند. نیتریت معمولا به صورت نیترات سدیم استفاده می شود، عمل ضد میکروبی نیتریت بر اساس تولید اسید نیترو می باشد. هم چنین به علت تولید اکسید ازت از اسید نیترو عمل ضد میکروبی این ترکیب صورت می گیرد. این ترکیبات با مختل کردن سیستم دهیدروژناز باعث عمل ممانعت کنندگی می شوند. خاصیت ضد میکروبی نیتریت با کاهش PH افزایش می یابد. قارچ ها و مخمرها تحت تاثیر نیتریت قرار نمی گیرند و عمل آن ها منحصرا ضد باکتریایی است. لازم به ذکر است که واکنش نیتریت با آمین ها تولید نیتروز آمین می کند که سرطان زا و جهش زاست لذا استاندارد بسیاری از کشور ها مصرف نیتریت را مجاز نمی دانند.

آنتی بیوتیک ها: انتی بیوتیک ها متابولیت های ثانویه ی تولید شده به وسیله ی میکروارگانیزم ها هستند مه اثر بازدارندگی یا کشندگی روی طیف وسیعی از میکروارگانیزم های دیگر را دارند. اکثریت انواع مفید این ترکیبات توسط کپک ها و باکتری های جنس استرپتومایسس تولید می شود. به طور کلی آنتی بیوتیک ها ترکیبات ضد باکتری بوده و فعالیت آن ها به PH بستگی ندارد، آنتی بیوتیک هایی که در مواد غذایی استفاده می شوند باید رخصوصیات زیر را داشته باشند:

1.   حتما باکتری ها را از بین ببرند.

2.   به وسیله ی ترکیبات غذایی غیر فعال شوند.

3.   باعث ایجاد میکروارگانیزم مقاوم نشود.

4.   خاصیت سمی نداشته باشد.

از آنتی بیوتیک های مهمی که در مواد غذایی استفاده می شوند:

·      تتراسایکلین ها (شامل الترا تتراسایکلین و کلرو تتراسایکلین) که جهت به تاخیر انداختن فساد در مواد غذایی گوشتی استفاده می شود. مشکل کاربرد این آنتی بیوتیک ها این است که علی رغم از بین بردن این باکتری ها محیط را برای رشد و تکثیر قارچ ها مناسب می سازند و لذا بایستی همراه این آنتی بیوتیک از یک ترکیب ضد قارچی نظیر سوربات ها استفاده شود.

·      نایسین که توسط باکتری استرپتوکوکوس لاکتیس تولید می شود، آنتی بیوتیکی است که برای مصرف ماده ی غذایی مجاز شناخته شده و بیشتر در پنیر و فراورده های نان برای جلوگیری از فساد کلستریدیوم ها استفاده می شود.

·      سوبتیلین آنتی بیوتیک دیگری است که در کنسرو ها استفاده می شود. این آنتی بیوتیک ساختمان پلی پپتیدی مشابه نایسین داشته و در جلوگیری از فساد و تشکیل توکسین توسط کلستریدیوم بوتولینوم موثرتر از نایسین است. سوبتیلین در کنسرو هایی که حرارت ملایم می بینند، استفاده می شود. در غذاهای اسیدی حرارت دیده، نایسین موثرتر است.

·      تایروزین نیز در کنسرو ها کاربرد دارد و موثرتر از نایسین است. آنتی بیوتیک های نایسین و سوبتیلین در مرحله ی ظهور سلول های رویشی از اسپورها عمل می کند اما تایروزین بر اسپورها موثر است.

·      پیمارسین آنتی بیوتیک دیگری است که اولین بار توسط استرپتومایسس ناتالنسیس (Streptomyces natalansis) جدا شده و پیمارسین دارای عمل ضد میکروبی روی کپک ها و مخمرها و باکتری هاست و بر روی غشای سلولی اثر می کند. به علت عمل قوی آن بر روی کپک ها به صورت سوسپانسیون بر روی سطح پنیر به کار می رود. هم چنین رشد کپک ها در سوسیس خام را می توان با فرو بردن آن در محلول 0/1-0/25% پیمارسین جلوگیری کرد.

نگهداری مواد غذایی با استفاده از پرتودهی:

به طور کلی اشعه های مورد استفاده در صنایع غذایی به دو صورت اشعه های حرارتی و اشعه های یویزه کننده هستند که تشعشعات یونیزه کننده از بیشترین اهمیت در صنایع غذایی برخوردارند. از اشعه های حرارتی نظیر ماکروویو و مادون قرمز برای گرم کردن مواد غذایی استفاده می شود، هر چند اشعه فرابنفش که آن هم غیر یونیزه کننده است سبب مرگ میکروارگانیزم ها می شود. اشعه های یونیزه کننده نظیر ایکس و گاما نیز اصولا جهت استریلیزاسیون و نگهداری مواد غذایی استفاده می شود.

راحت ترین و ارزان ترین اشعه برای استفاده در صنایع غذایی اشعه ی گاماست که برای تهیه آن از کبالت و سزیم استفاده می شود. یون هایی که در اثر تابش در مواد غذایی تولید می گردند، بلافاصله از طریق تغییر ساختمان دیواره ی سلولی و تاثیر روی فعالیت آنزیم های متابولیکی میکروارگانزم ها آن را زخمی کرده یا از بین می برند. به هر حال مهم ترین تاثیر روی مولکول های DNA یا RNA سلول می باشد که برای رشد و تکثیر لازم هستند.

هنگام بررسی اثر اشعه بر روی میکروارگانیزم ها چند فاکتور باید مد نظر قرار بگیرد که عبارتند از:

1.   نوع میکروارگانیزم: ویروس ها نسبت به پرتودهی مقاوم هستند و با سطوح دزهای قابل استفاده در عمل آوری تجاری تحت تاثیر قرار نمی گیرند. در مورد باکتری ها به طور کلی باکتری های اسپورزا مقاوم تر از باکتری های بدون اسپور هستند، هم چنین باکتری های G+ نسبت به باکتری های G- در مقابل اشعه مقاوم ترند. سودومناس و فلاووباکترها حساس ترین باکتری ها نسبت به اشعه هستند. در مقایسه با باکتری ها کپک ها و مخمرها نسبت به اشعه حساس ترند. حشرات و انگل ها حساس ترین موجودات به اشعه اندو پایین ترین دز مورد استفاده در تجارت را نیاز دارند.

2.   تعداد ارگانیزم ها: هنگام استفاده از میزان مشخصی از اشعه با افزایش تعداد سلول ها اثر اشعه کاهش می یابد. پس هر چه بار میکروبی بیشتر باشد، دز مورد استفاده نیز باید بیشتر باشد.

3.   ترکیب ماده ی غذایی: به طور کلی وقتی میکروارگانیزم ها به صورت سوسپانسیون در محلول های بافر قرار بگیرند در مقایسه با حالتی که در محیط حاوی پروتئین قرار داشته باشند، نسبت به اشعه حساس ترند. پروتئین ها اثر محافظت کنندگی در مقابل اشعه دارند.

4.   حضور یا عدم حضور اکسیژن: مقاومت میکروارگانیزم ها نسبت به اشعه در غیاب اکسیژن بیشتر از حالتی است که اکسیژن حضور داشته باشد. افزودن مواد احیا کننده نظیر ترکیبات سولفیدریل اثر مشابهی در افزایش اثر مقاومت سلول نسبت به اشعه در یک محیط هوازی دارند.

5.   حالت فیزیکی ماده غذایی: به طور کلی مقاومت سلول های خشک نسبت به اشعه بیشتر از سلول های مرطوب می باشد. هم چنین مقامت سلول های منجمد در مقابل اشعه بیشتر از سلول های غیر منجمد است.

6.   سن ارگانیزم: باکتری های در فاز تاخیری و دقیقا قبل از تقسیم سلولی بیشترین مقاومت را نسبت به اشعه از خود نشان  می دهند. حساسیت سلول ها با ورود آن ها به فاز لگاریتمی افزایش می یابد و در انتهای این فاز، مقاومت آن ها به حداقل   می رسد.

برای مواد غذایی سه سطح پرتوافکنی وجود دارد که عبارتند از:

1.   Radappertization: هدف از این سطح اشعه نابودی اسپور های کلستریدیوم بوتولینوم در مواد غذایی کم اسید است و مقدار دز لازم از اشعه برای این منظور حدود 4/1 مگاراد (MRad) یا 41 کیلو گری (KGray) است (راد و گری از جمله واحدهای اندازه گیری اشعه هستند). به این نوع استریلیزاسیون به دلیل عدم تولید حرارت در طی فرایند استریلیزاسیون سرد گفته می شود.

2.   Radurization: معادل پاستوریزاسیون بوده و مقدار دز لازم از اشعه حدو 0/25-1 MRad می بشاد.

3.   Radicidation: این سطح از تشعشع برای نابود کردن برخی میکروارگانیزم های خاصی استفاده می شود. مقدار دز لازم از اشعه برای این سطح 0/75-2/5 KGray می باشد.

لازم به ذکر است که پرتو افکنی مواد غذایی علی رغم اثرات مفید زیاد آن دارای یک سری اثرات سوء نیز می باشد مثلا در اثر تشعشع پروتئین ها به پپتیدها و در نهایت به H₂S و آمین ها تبدیل می شود که مواد تولید شده علاوه بر نامطلوب کردن طعم، ضررهای دیگری نیز دارند. هم چنین پرتوافکنی باعث تجزیه ی رنگ ریزه ها و ویتامین های موجود در غذاها شده و در این بین ویتامین های مخلوط در چربی ها حساس ترند به طور کلی تشعشع باعث یونیزه شدن اسید های چرب و تولید رادیکال های آزاد اسید های چرب شده و در نتیجه سبب اکسیداسیون چربی ها و تند شدن آن ها می شود.

نگهداری مواد غذایی با استفاده از دمای پایین:

استفاده از دماهای پایین جهت نگهداری مواد غذایی بر این اساس استوار است که فعالیت میکروارگانیزم های موجود در مواد غذایی در حرارت های بالای انجماد کند و به طور عمومی در حرارت های پایین تر از انجماد متوقف می گردند چرا که تمامی واکنش های متابولیکی ارگانیزم ها توسط آنزیم کاتالیز می شود و سرعت واکش های آنزیمی نیز به درجه حرارت وابسته است. به طوری که با کاهش هر 10 درجه سانتی گراد، سرت واکنش آنزیمی نصف می شود، تاثیر دمای پایین بر روی همه ی میکروارگانیزم ها یکسان نیست، همان طور که می دانید میکروارگانیزم ها بر اساس اپتیمم درجه حرارت مورد نیاز و حداقل و حداکثر دمای رشد و زندمانی آن ها تقسیم بندی می شوند. به طوری که میکروارگانیزم های سرمادوست و سرمازی در دمای پایین زنده مانده یا آن را تحمل می کنند. در حالی که دمای پایین، رشد اکثر میکروارگانیزم های مزوفیل و ترموفیل را متوقف نموده یا آن ها را از بین می برد. از جماه عواملی که سبب زنده ماندن و تحمل ارگانیزم های سرمادوست و سرمازی در دمای پایین می شود، میزان بیشتر اسید های چرب غیر اشباع در دیواره ی سیتوپلاسمی آن ها می باشد. چرا که اسید های چرب غیر اشباع باعث فعال نگهداشتن غشای سلولی شده و حیات سلول میکروبی نیز به طور کلی بستگی به عملکرد غشاء دارد. در مقابل از جمله عللی که باعث می شود میکروارگانیزم های مزوفیل و ترموفیل در دماهای پایین متوقف شوند عبارتند از:

1.   در دمای پایین تعداد پیوند هیدروژنی افزایش یافته و بدین ترتیب پیچیدگی پروتئین ها بیشتر می شود و این پیچیده تر شدن پروتئین ها باعث کاهش فعالیت می شود.

2.   در دماهای پایین فعالیت آنزیم های چنین میکروارگانیزم هایی مختل شده و لذا نمی توانند رشد بکنند و هم چنین در دمای پایین تولید ATP کاهش می یابد.

3.   ساختار غشای سلولی میکروارگانیزم های مزوفیل و ترموفیل در دماهای پایین آسیب دیده و باعث ایجاد اشکال می شود.

نگهداری مواد غذایی با استفاده از حرارت:

علت ستفاده از حرارت در نگهداری مواد غذایی اثر تخریبی آن بر روی میکروارگانیزم هاست. منظور از درجه حرارت های بالا دماهایی بیش از دمای محیط اطراف است. به طور معمول برای نگهداری مواد غذایی از دو نوع فرایند حرارتی پاستوریزاسیون و استریلیزاسیون استفاده می شود. هدف از پاستوریزاسیون از بین بردن کلیه ی میکروارگانیزم های     بیماری زا و از بین بردن یا کاهش تعدادی از میکروارگانیزم های عامل فساد در برخی از مواد غذایی است. استریلیزاسیون به معنی تخریب تمام ارگانیزم های زنده ای است که قابل اندازه گیری  هستند. برای مواد غذایی کنسرو شده اصطلاح استریلیزاسیون تجاری استفاده می شود. این اصطلاح بیان گر این نکته است که هیچ ارگانیزم زنده ای با روش های کشت معمول قابل اندازه گیری نیست و یا اینکه تعداد ارگانیزم های زنده آن به قدری کم است که تحت شرایط کنسرو کردن و نگهداری ماده ی غذایی در انبار هیچ اهمیتی ندارد.

عموما مقاومت حرارتی میکروارگانیزم ها به دمای اپتیمم رشدشان بستگی دارد. سایکروفیل ها حساس ترین میکروارگانیزم ها به حرارت هستند و پس از آن ها به ترتیب مزوفیل ها و ترموفیل ها قرار دارند. مقاومت حرارتی میکروارگانیزم های اسپورزا بیشتر از میکروارگانیزم های بدون اسپور است. باکتری های G+ مقاوم تر از باکتری های G- هستند. هم چنین کوکسی ها (باکتری های کروی) از میله ای های غیر اسپورزا مقاوم ترند و حساسیت کپک ها و مخمرها به حرارت، در حد متوسط است.

نگهداری مواد غذایی با استفاده از فرایند خشک کردن:

طولانی کردن زمان نگهداری مواد غذایی به روش خشک کردن بر اساس نیاز میکروارگانیزم ها و آنزیم ها به آب برای فعالیت استوار است. در نگهداری مواد غذایی با این روش رطوبت آن ها تا حدی کم می گردد که از میکروارگانیزم های عامل فساد و مسمویت غذایی جلوگیری شود اگر چه برخی میکروارگانیزم ها طی فرایند خشک کردن از بین می روند. ولی اندوسپور باکتری ها، اسپور مخمرها و کپک ها و برخی از باکتری های G- و G+ زنده باقی می مانند. برخی از انگل های آلوده کننده نیز در طی فرایند خشک کردن ماده ی غذایی زنده می مانند. به طور کلی سلول های جوان نسبت به سلول های پیر حساسیت بیشتری نسبت به خشک کردن دارند.

جلسه ی هشتم: 19/9/90

ج) هوازی اجباری: این دسته به دو گروه تقسیم می شوند:

1. ترموفیل: سردسته ی این گروه کلستریدیوم ترموساکارولیتیکم (Cl.thermosaccharolyticum) است که روی کروبوهیدرات ها رشد کرده و مقدار زیادی CO₂ و H₂ تولید می کند، بنابراین مشخصه ی این نوع فساد بادکردگی بسته هاست. دمای مناسب رشد این گروه 55 درجه سانتی گراد است و در حرارت حدود 30 درجه سانتی گراد قادر به رشد نیستند. بنابراین در هوای معتدل و سرد این گروه، عامل فساد نمی باشند. این گروه اسپورزا هستند و مقاومت حرارتی اسپور آن ها بالاست. گونه ی دیگر در این دسته کلستریدیوم نیگریفیکانس (Cl.nigrificans) که از پروتئین ها استفاده کرد و H₂S تولید می کند و چون این گاز در محتوی بسته، محلول است تورم کمتر مشاهده می شود. اما به دلیل وجود H₂S، بدنه ی داخلی قوطی و محتوی آن سیاه رنگ می شود. از این گروه گونه های دیگری مانند کلستریدیوم پوتریفاشنس، کلستریدیوم اسپورژنس (Cl.sporengenes) و کلستریدیوم هیستولیتیکم (Cl.histolyticum) را نیز می توان نام برد که پروتولیتیک هستند. هم چنین کلستریدیوم پرفرینژنس (Cl.perfrigenes)، کلستریدیوم پاستوریانوم (Cl.pastuerianum) و کلستریدیوم بوتیریکم (Cl.botyricoum) گونه های ساکارولیتیک بی هوازی و اسپورزا هستند که مقاومت حرارتی بیشتری در مقایسه با گونه های پروتئولیتیک دارند. در کنسرو و فراورده های گوشتی و ماهی مهمترین عامل فساد کلستریدیوم پرفرینژنس است.

2. مزوفیل: مهمترین و خطرناک ترین گونه ی این گروه کلستریدیوم بوتولینوم (Cl.botulinum) است که مقاومت حرارتی زیادی ندارد اما اسپور ان از مقاومت حرارتی بالایی برخوردار است.

د) مخمر ها، کپک ها و باکتری های غیراسپورزا: به دلیل عدم توانایی تولید اسپور و مقاومت حرارتی کم، نقش زیادی در فساد کنسروها ندارند مگر در مواردی که فرایند حرارتی به دلایل خاصی مورد استفاده قرار نگرفته باشد. سودمناس فلوئورسنس با سنتز لیپاز سبب Rancid (تندی) می شود. بایسوکلامایس فولوا، رودوتورولا لاکتی کوندنسی (Rhodotorula lacti condensi) باد کردگی شدید در شیر کندانسی شیرین (محصولی که تغلیظ شده و شیرین می شود) را موجب می شود.

فساد کنسروهای اسیدی و با اسیدیته ی بالا:

در کنسروهای اسیدی ارگانیسم های مختلفی قادر به رشد هستند که می توان به موارد زیر اشاره کرد. باسیلوس کوآگولانس، کلستریدیوم بوتیریکم، کلستریدیوم پاستوریانوم، باسیلوس پلی مگزا، باسیلوس ماسرانس (B.macerans) که دو گونه ی اخیر فساد گاز دار ایجاد می کنند. غیر اسپور زای مزوفیل مثل لاکتوباسل ها و باکتری های اسید لاکتیک و هم چنین انواع مختلف مخمر ها و کپک ها که معمولا در صورت کافی نبودن فرایند حرارتی یا نشت کردن قوطی ها وارد محصول شده و باعث فساد می شوند.

در کنسرو هایی با اسیدیته ی بالا به طور کلی مزوفیل های غیر اسپورزا، نظیر باکتری های اسید لاکتیک و مخمر ها و کپک ها عامل فساد در این فراورده ها هستند. ظاهر قوطی ها تا حدودی مشخص کننده ی پیشرفت فساد خواهد بود. دو سر قوطی در حالت عادی مسطح یا اندکی مقعر است ولی در صورت فعالیت میکروارگانیزم ها و تولید گاز یک سری تغییرات قابل رویت در ظاهر قوطی یجاد می شود.

Fllipper: به حالتی اتلاق می شود که دو سر قوطی عادی است اما پس از حرارت دیدن یا ضربه خوردن به صورت محدب در می آید.

Springer: در این حالت یک طرف قوطی متورم است به طوری که اگر از یک انتها به سمت داخل فشار دهیم، طرف دیگر با تولید صدا محدب می شود.

Soft swell or Hard swell (تورم نرم یا سخت): Soft swell به حالتی اشاره دارد که دو انتهای محدب قوطی با فشار انگشت مقعر می شود ولی چنان چه قوطی های محدب را نتوان با فشار انگشت به حالت اول درآورد، قوطی در حالت  Hard swell  یا تورم سخت خواهد بود.

علائم Flipper و Springer همواره معرف فساد میکروبی نیست بلکه می تواند ناشی از فساد شیمیایی یا فییکی باشد اما تورم های نرم همانند تورم سخت غالبا مشخص کننده ی فساد میکروبی می باشند.

H₂ و CO₂ و H₂S : گازهایی هستند که به فراوانی در کنسرو های فاسد شده رویت می شوند، این گازها تحت تاثیر فعالیت متابولیکی میکروارگانیزم ها تولید می شوند. گاز های H₂S را به واسطه ی بوی مشخص آن می توان تشخیص داد اما گاز های CO₂ و H₂ فاقد چنین مشخصه ای بوده و آن ها را از طریق آزمایش زیر شناسایی می کنند:

لوله ی آزمایش را با محلول KOH رقیق پر کرده، آن را به صورت وارونه روی منفذی که روی سطح قوطی ایجاد کرده ایم، قرار می دهیم. گاز های درون قوطی جایگزین KOH رقیق داخل لوله خواهد شد سپس قبل از خارج کردن لوله از بشر انتهای آن را توسط انگشت شصت مسدود می کنم. حال برای شناسایی گاز CO₂ لوله را تکان می دهیم که در اثر خلاء بوجود آمده (به دلیل حل شدن CO₂ در محلول KOH) انگشت به داخل لوله مکیده می شود. برای شناسایی گاز H₂ کبریت روشنی را نزدیک انتهای لوله نگهداشته و به سرعت انگشت شصت را بر میداریم، صدای انفجار ضعیفی مشخص کننده ی گاز هیدروژن است. برخی از کنسروهای فاسد ممکن است حاوی هر دو نوع گاز یاد شده باشند.

روش های نگهداری مواد غذایی از دیدگاه میکروبیولوژی:

نگهداری مواد غذایی با استفاده از ترکیبات شیمیایی:

به طور کلی مواد شیمیایی که در نگهداری مواد غذایی مورد استفاده قرار می گیرند، باید دارای خصوصیات زیر باشند:

1.    خاصیت مهار کنندگی میکروب ها

2.    عدم ایجاد حساسیت یا آسیب برای انسان

3.    قابلیت تعیین و شناسای با روش های جدید

4.    داشتن قدرت نگهداری مواد غذایی در حد مجاز

GRAS (Generally Recognized As Safe): در مورد مواد شیمیایی اصطلاحی به نام GRAS وجود دارد که به معنی آن به طور خلاصه سالم و مجاز بودن یک ماده شیمیایی برای سالم بودن در یک ماده غذایی است. از جمله ی این نگهدارنده ها می توان به موارد زیر اشاره کرد:

اسید بنزوییک، بنزوات و پارابن ها: بنزوات سدیم اولین ماده شیمیایی است که مصرف آن به عنوان نگهدارنده ی مواد غذایی از طرف اداره ی کنترل دارو و مواد غذایی آمریکا مجاز شناخته شد. فعالیت ضد میکروبی اسید بنزوییک و نمک های آن به PH محیط بستگی دارد، چرا که فعالیت ضد میکروبی اسید بنزوییک مربوط به مولکول تفکیک نشده ی آن است. این ترکیبات حداکثر فعالیت خود را در پایین ترین PH مواد غذایی نشان می دهند و اساسا در PH خنثی غیر موثرند. این امر سبب محدود شدن استفاده از این اسید و نمک آن در مواد غذایی اسیدی مانند آب سیب، نوشابه های الکلی، سس گوجه فرنگی و سس های سالاد شده است. بنزوات در مواد غذایی اسیدی به طور معمول به عنوان بازدارنده ی کپک ها و مخمرها عمل می کند. البته این ماده در دامنه ی 50 تا 500 ppm روی برخی از باکتری ها نیز موثر است. برای غذاهایی که دارای PH حدود خنثی (6-7) هستند، می توان از نمک های پاراهیدروکسی بنزوییک اسید (پارابن) استفاده کرد که مشتقات مختلفی از جمله متیل پارابن و پروپیل پارابن و ... را شامل می شود. این ترکیبات نسبت به تغییرات PH حساسیت کمتری نشان می دهند و در PH حدود خنثی قدرت میکروب کشی نسبت به سایر اسید ها دارند و به نظر می رسد پارابن ها بر روی کپک ها بیش از مخمر ها موثر است. پارابن ها از رشد برخی باکتری های G- و G+ نیز جلوگیری می کند. اما به طور معمول     باکتری های G+ بیش از باکتری های G- نسبت به پارابن ها حساسند. بنزوات ها و نمک های آن از طریق جلوگیری از جذب سلولی مولکول های سوبسترا مانع رشد میکروارگانیزم ها می شوند.

اسید استیک: ترش کردن مواد غذایی در سرکه که از روش های نگهداری مواد غذایی است. در مقایسه با سایر اسید های ممانعت کننده ی میکروبی، غلظت لازم اسید استیک برای این منظور خیلی بالاست و تنها در غلظت های بالای 0/5 % عمل ضد میکروبی ظاهر می شود. اسید استیک در حالت یونیزه شده می تواند به راحتی داخل سلول نفوذ نموده و عمل سمی خود را انجام دهد. این به علت قدرت حلالیت اسید استیک در لیپید می باشد. دامنه ی فعالیت اسید استیک اساسا روی باکتری هاست و روی قارچ ها کم تر اثر دارد. باکتری های مقاوم به اسید مانند لاکتوباسیل ها تحت تاثیر قرار نمی گیرند. گونه های باسیلوس و باکتری های G- در مقایسه با باکتری های اسید لاکتیک، کلستریدیوم ها و دیگر باکتری های G+، کپک ها و مخمرها بیشتر تحت تاثیر اسید استیک قرار می گیرند.

اسید سیتریک: اگر چه این اسید به عنوان عامل ضد میکروبی محسوب می شود ولی به اندازه ی سایر اسید ها و مواد نگهدارنده موثر نیست. این اسید بر روی باکتری های فاسد کننده ی آب گوجه فرنگی موثر است. عمل باکتریواستاتیکی (مهار کنندگی (Bacteriostatic) این اسید در PH=5 کم بوده و با کاهش PH عمل ضد میکروبی افزایش می یابد.

اسید لاکتیک: عمل ضد میکروبی این اسید توسط کاهش PH تا حدی است که باکتری ها قادر به رشد نباشند. اسید لاکتیک در PH=5 یک ممانعت کننده ی عالی برای باکتری های مولد اسپور است ولی روی کپک ها و مخمرها بدون تاثیر است.

اسید پروپیونیک: عمل ضد میکروبی اسید پروپیونیک این است که در سلول جمع شده و با ممانعت آنزیم، متابولیسم را بلوکه می کند. اسید پروپیونیک هم چنین با رقابت با سایر مواد لازم برای رشد میکروارگانیزم مانع رشد می شود. طیف عمل این اسید و نمک های آن ابتدا روی کپک هاست. این اسید و نمک های آن برای نگهداری نان و محصولات مشابه استفاده        می شود. چون عمل پروپیونات ها روی مخمر نسبتا اندک است، در نان پزی مانع عمل مخمر های مفید در تولید نان        نمی شود.

اسید سوربیک: عمل ضد میکروبی اسید سوربیک و نمک های آن در ایتدا روی مخمر ها و کپک هاست و اثر آن روی باکتری ها محدود به بعضی از باکتری ها می شود. باکتری های کاتالاز مثبت بیشتر از باکتری های کاتالاز منفی ممانعت   می شوند. بیشترین اثر روی باکتری های هوازی اجباری و کمترین اثر روی باکتری های اسید لاکتیک و کلستریدیوم هاست. غلظت موثر ضد میکروبی سوربات ها در اغلب مواد غذایی حدود 0/05 یا 0/3 درصد است. عمل ضد میکروبی اسید سوربیک بر اثر ممانعت آنزیم های متعدد در سلول میکروبی است. اسید سوربیک قادر است که به صورت غیر یونیزه از دیواره ی سلولی عبور کرده و سبب از بین رفتن ارگانیزم ها می شود. در PH پایین مقدار بیشتری از این اسید به صورت غیر یونیزه باقی می ماند. در محصولات لبنی، نان ها، میوه ها و سبزی ها و بعضی از محصولات گوشتی، ماهی و    شیرینی جات از سوربات استفاده می شود.

ltr/span) هستند، می توان از نمک های پاراهیدروکسی بنزوییک اسید (پارابن) استفاده کرد که مشتقات مختلفی از جمله متیل پارابن و پروپیل پارابن و ... را شامل می شود. این ترکیبات نسبت به تغییرات dir=

اسپکتروفتومتری تشدید مغناطیسی هسته NMR

«اسپکتروفتومتری تشدید مغناطیسی هسته NMR»

 وقتی پروتونی را در میدان مغناطیسی خارجی قرار می دهیم حاصل قرار گرفتن آن ایجاد چرخشی دیگر است. به فرکانس چرخش پروتون در میدان مغناطیسی فرکانس تقدمی پروتون ها می گویند و پروتونها به این ترتیب می توانند امواجی هم فرکانس با فرکانس چرخش را جذب کنند و جذب و نشر انرژی در پروتون ها اتفاق می افتد.

در ساخت دستگاه NMR به دو طریق می توان عمل کرد.

1- تغییر میدان مغناطیسی

2- تغییر فرکانس رادیویی

دستگاهی که در آن فرکانس ثابت است و میدان را به میزان مختصر تغییر می دهیم ساده تر است.

دستگاههای NMR  میدان آنها در محدوده کوچکی تغییر می کند و فرکانس ثابتی به همه پروتون ها می تابد.

بنابراین این نوع دستگاه یک میدان اولیه ثابت و یک میدان ثانویه متغیر دارد که sweep generator این کار را انجام می دهد. به این دستگاهها دستگاه continuous wave (c.w) میگویند.

دستگاههای جدید FT-NMR یا pulse-NMR

به این دستگاهها pulse NMR system گویند. هر پالس شامل تمام فرکانس هایی است که برای رزونانس رسیدن تمام پروتونها لازم است که در 0.01 ثانیه فراهم می شود.  میدان در آنها ثابت است و فرکانس تغییر می کند Magnet باید همواره روشن باشد تا یکنواختی میدان به هم نخورد در زمان کوتاه پالسی به نمونه فرستاده می شود که حاوی تمام فرکانس هایی است که برای به رزونانس رسیدن همه پروتون ها لازم است.

1- با این روش می توان تعداد زیادی طیف را در فواصل زمانی کوتاه گرفت

2- همچنین می توان از هسته هایی با فراوانی کم هم می توان طیف گرفت.(افزایش حساسیت)

3- از نمونه، با مقدار کم طیف بگیریم

طیف گیری از نمونه مقدار کم: زیرا با این دستگاهها می توان در زمان کوتاه تعداد Scanها را زیاد کرد که با جمع کردن پیک ها noise به اندازه پیک اصلی افزایش نمی یابد. افزایش شدت پیک ها با رادیکال تعداد اسکن متناسب است. اما از حدی بیشتر با افزایش تعداد اسکن هم طیف خوبی نمی گیریم و فقط باید مقدار نمونه را زیاد کنیم.

برای یکنواخت (ثابت) بودن میدان لازم است مگنت دائما روشن باشد. روشن بودن دائمی مگنت گرماایجاد می کند با استفاده از chiller آن را خنک می کنیم. مگنت دستگاه ما الکترومگنت فرکانس 80HTZ و میدان حدود 2Tesla است. البته از80HTZ  به بالا دیگر از الکترو مگنت استفاده نمی شودو به جای آن  از مواد ابر رسانا superconductive  برای ایجاد میدان استفاده می شود اما این مواد  در دمای زیر صفر این خاصیت را دارند که برای تامین این دما از ازت یا هلیم مایع استفاده می شود. (عیب آن)

هر چه میدان را قویتر کنیم R(resolution)بیشتر می شود.

دستگاه قدیمC.W-NMR

میدان در محدوده کوچکی تغییر می کند و فرکانس ثابتی به همه پروتون ها می تابد.

 محل جذب پروتون ها در NMR را محل شیفت شیمیایی پروتون ها می گویند. محل شیفت اطلاعات زیادی راجع به ساختمان جسم و محل قرار گرفتن پروتون ها به ما می دهد.

محل جذب:

محل شیفت شیمیایی را بر مبنای استانداردی به نام TMS تترامتیل سیلان بیان می کنیم جذب TMS در صفر PPM است مهمترین عامل موثر بر شیفت شیمیایی الکترونهای های اطراف پروتون است هر چه eها بیشتر روی پروتون ها اثر شیلدینگ بگذارند اثر میدان مغناطیسی کم شده و باید بر شدت میدان مغناطیسی افزوده شود.

TMS محافظت شده ترین پروتونها ها را دارد بنابراین به شدت از میدان مغناطیسی کم می کند و باید بر شدت میدان افزوده شود. بنابراین صفر بالاترین میدان مغناطیسی را دارد.

یک قطره TMS به همه نمونه ها اضافه می شود برای اینکه پیک صفر داشته باشیم- چون TMS 12 پروتون دارد که از لحاظ شیمیایی یکسان هستند با یک قطره جواب می دهد. در 27°C به جوش می آید و از نمونه ها به راحتی جدا می شود.تنها مشکل TMS اینست که با حلال های مائی قابل اختلاط نیست.

برای طیف از حلال مائی: TMS را در لوله مویین می ریزیم و آن را در لوله NMR می اندازیم  (استاندارد خارجی )ویا از DSS سدیم 2,2 دی متیل، سیلاپنتا سولفونات استفاده می کنیم . این ماده هم با یک قطره یک پیک شارپ می دهد.

استفاده از استاندارد خارجی دقت زیادی ندارد بعلت عدم یکنواختی اثرمیدان بر نمونه واستاندارد .

با دستگاه NMR قدیمی(CW-NMR) حدود 50mg نمونه و 0.5cc حلال لازم داریم در دستگاه جدید با 5mg هم می توان طیف گرفت.

وقتی از ماده ای مثل اتیل بروماید طیف می گیریم دو نوع پروتون داریم.

برای یافتن تعداد پروتون ها در هر محل احتیاج به انتگرال گیری داریم.

بنابراین قلم را طوری تنظیم می کنیم که جایی که پیک ندارد خط صاف رسم کند و ابتدای هر پیک متناسب با تعداد پروتون ها بالا رود.پروتون های تحت تاثیر اسپین پروتون ها کربن مجاور هم قرار می گیریند که باعث شاخه دار شدن پیک ها می شود.

تعداد شاخه ها= تعداد پروتون های کربن مجاور +1

وقتی پروتونی از دو طرف تحت تاثیر اسپین کربن مجاور قرار بگیرد فواصل شاخه ها J گفته

 می شود.اگر هر دو کربن مجاور یک پروتون با یک J اثر بگذارند بعضی شاخه ها روی هم می افتند.بنابراین تعداد شاخه ها از فرمول (n_A+n_B+1) بدست می آید.مقدار J گاهی برای شناسایی ترکیب به کار می رود و در ترکیبات ترانس مقدار J بیشتر است و برای شناسایی شکل فضایی ترکیب به کار می رود.

قسمت های مختلف دستگاه NMR:

1- میدان اولیه ثابت Magnet

2-میدان ثانویه متغییر sweep generator

3- فرستنده امواج رادیویی

4- گیرنده امواج رادیویی

5- رکوردر

6- لوله محتوی نمونه

تهیه نمونه:

مهمترین حلال بدون پروتون در NMR ،ccl₄ است اگر ترکیب در آن حل شود ، بعدCDCL₃ کلروفرم دو تره و بعد CD₃OD متانول دوتره و D₂O و در نهایت DMSO دی متیل سولفوکساید استفاده می شود(هر چه تعداد D در حلال بیشتر شود گران تر می شود.)

حلال های دو تریوم صد در صد خالص نیستند و پیک حلال دیده می شود مثلا پیک پروتون کلرفروم مربوط به CDCL₃ در 7.22ppm ظاهر می شود معمولا حلال های 99.5% استفاده می شود البته 99.999% هم وجود دارد که خیلی گران است.

اگر جسم در هیچ کدام از حلال های گفته شده حل نشد در CF₃COOH حل می کنیم پروتون اسید پیک می دهد.

اگر در حدود ppm12-11 ببینیم احتمال می دهیم پیک اسید است برای مطمئن شدن بعد از طیف گرفتن یکی دو قطره آب دو دوتره اضافه می کنیم و دوباره پیک می گیریم اگر پیک شدتش خیلی کم شد پروتون اسید بوده که قابل تبادل بوده است.

برای کالیبراسیون دستگاه NMR از ترکیبی استفاده می شود که پیک های sharp داشته باشد، مثل اتیل بنزن که سه نوع پروتون و سه پیک دارد.

روش کار C.W-NMR:

برای کالیبراسیون دستگاه، نمونه اتیل بنزن را داخل لوله NMR ریخته و داخل Magnet می گذاریم و با 20 دور در ثانیه آن را می چرخانیم .

هر 60HZ=1 ppm

زمان sweep (اسکن)، 50 ثانیه است.

با استفاده ازsweep zero، TMS را روی صفر تنظیم می کنیم.

شدت پیک ها را با Spectrum amplitude تنظیم می کنیم.

هدف از استفاده اتیل بنزن تنظیم دستگاه و اطمینان از تعداد شاخه هایی است که دستگاه می دهد. 

بعد از گرفتن طیف، انتگرال گیری را انجام می دهیم و برای این کار دکمه INT را می زنیم.

سپس دکمه reset را می زنیم برای اینکه مطمئن شویم که قلم ثبات به بالای کاغذ بر خورد

 نمی کند ابتدا قلم را بالا آورده و انتگرال می گیریم و بعد از اطمینان از مناسب بودن شدت انتگرال انتخاب شده ، قلم را پایین می آوریم و انتگرال می گیریم.

برای در آوردن نمونه spin را قطع کرده و دکمه eject را می زنیم.

با پیچ vertical قلم را پایین می آوریم ،کنترل عمودی و پیک را رسم می کنیم اگر شدت زیاد بود شدت را کم می کنیم تنظیم شدت با spectrum amplitude است.

نمونه: بوتیریک اسید

برای مشاهده پیک اسید عرض صفحه را دو برابر می کنیم و برای اینکه روی پیک های قبلی نیفتاد قلم را بالا می آوریم و برای مشاهده پیک اسید off set  600HZ=5ppm می کنیم و مقدار offset را با محل جذب جمع می کنیم در اینجا 6ppm را off set کردیم.

وقتی پیک ها از هم فاصله کمی داشته باشند. انتگرال پیوسته می گیریم زیرا خط پایه مشخص نیست تا برای پیک بعدی روی آن reset  کنیم.

روش کار pulse-NMR

در شروع کار باید از یکنواخت بودن میدان مطمئن شویم که مشخص کننده میدان ثابت، سیگنال دوتریوم است. یعنی اصطلاحا" میدان را روی سیگنالی که از دوتریوم می آید lock می کنیم. (Lock D₂) تا وقتی Lock برقرار باشد میدان هموژن است و می توان طیف گرفت. تا وقتی چراغ روشن باشد و اگر به هر دلیلی lock از دست برود مانند رفتن برق و ... هموژن بودن از بین رفته و حتی روی پیک های گرفته شده نمی توان حساب کرد و باید مجددا طیف گرفت. برای تامین سیگنال دوتریوم در همه حلالها دوتریوم داریم و حتی اگر نمونه تترا کلرید کربن (بهترین حلال) حل شود باز هم مقداری کلروفرم دوتره برای برقراری lock به آن اضافه می کنیم .

طیف گیری از هسته های با فراوانی کمتر: ¹³C در این مورد مهم است زیرا با فراوانی1.1% دارای اسپین 2/1 است. استفاده از طیف ¹³C وقتی اهمیت دارد که مثلا آلکان داریم زیرا تمام آلکان ها در PNMR پیک مشابه در ناحیه ppm 101-0.9 می دهند. اما محل جذب آلکانها در ¹³CNMR در محدوده بیشتر 15-35ppm است بنابراین در طیف ¹³C هر کربنی یک پیک می دهد مگر دو کربن که شرایط کاملا یکسان داشته باشند، یعنی محدوده وسیع طیف ¹³C سبب می شود کربن ها با اختلاف جزئی نیز با فواصل مناسب ppm 6-5 از هم جدا شوند.

محدوده جذب در PNMR ، 0-15ppm ولی در ¹³CNMR ، O-200ppm است که سبب ایجاد پیک های مستقل می شود.

مثلا در طیف PNMR اتیل بنزن 3 پیک زیر را دیدیم.

1-     شاخه ppm 1

2-     4 شاخه 2ppm

3-     پیک آروماتیک 7ppm

ولی در طیف ¹³CNMR اتیل بنزن 6 پیک می بینیم.

در طیف ¹³C ، splitting شاخه شاخه شدن نداریم. زیرا اثر پروتونها بر C را خودمان با عمل decoupling از بین می بریم تا طیف ساده تر شود و در مورد اثر ¹³C بر ¹³C هم احتمال کنار هم قرار گرفتن و مزدوج شدن دو ¹³C حدود صفر است پس در طیف ¹³CNMR پیک ها یک شاخه است و سطح زیر پیک نداریم.

بعلاوه ارتفاع پیک ها که نشان دهنده تعداد ¹³C در یک موقعیت خاص می باشد، هیچ اطلاعی در مورد ساختمان جسم نمی دهد، چون وجود ¹³C در مولکول، اتفاقی است و حتی ممکن است وقتی طیف کربن های همسان روی هم افتاده پیک کوچکتری ببنیم.

بنابراین در ¹³CNMR تنها محل شیفت شیمیایی است که اطلاعاتی در مورد ساختمان جسم می دهد.

کار با دستگاه pulse-NMR :

 گرفتن طیف هیدروژن اتیل بنزن و طیف کربن اتیل بنزن: در دستگاه یک مخزن آب برای خنک کردن مگنت وجود دارد. نمونه می چرخد تا تحت تاثیر یکنواخت میدان قرار گیرد.

همانند دستگاه قبل ارتفاع نمونه ها را تنظیم کرده و در مگنت قرار می دهیم. سپس Spin را روشن می کنیم. نمونه شروع به چرخش می کند. سیگنال دوتریوم را پیدا کرده و در وسط صفحه تنظیم می کنیم سپس دکمه lock را می زنیم تا lock D₂ برقرار شود و چراغ روشن شود و میدان یکنواخت گردد. برای کالیبره کردن دستگاه NMR از اتیل بنزن طیف می گیریم دستگاه وقتی تنظیم است که با یک scan طیف خوبی از اتیل بنزن بگیریم. برای طیف کربن وقتی تنظیم است که با یک Scan طیف خوبی را اتیل بنزن 80% بگیریم پس از گرفتن طیف انتگرال می کنیم.

منبع: وب شیمی www.WebShimi.ir

گاز کروماتوگرافی جرمی GC-Mass

«گاز کروماتوگرافی جرمی   GC-Mass»

  شناسایی دستگاه GC-Mass

مشابه دستگاه GC است. تنها تفاوت آن با GC معمولی این است که در این دستگاه دتکتور مربوطه دتکتور Mass است .تفاوتهای دیگر آن عبارتند از 1- از ستون موئینه (کاپیلری) استفاده می کنیم. نوع ستون به اسم تجارتی DB-5 است. از نظر پلاریته ستون دارای پلاریته متوسطی است. طولش m30است و برای کارهای عمومی استفاده می شود از آنجا که عوض کردن ستون زیاد ساده نمی باشد. سعی می کنیم ستونی را انتخاب کنیم که نمونه های زیادی را با آن تعیین کنیم.

2- احتیاج به حجم نمونه خیلی کمی برای تزریق داریم. معمولا 0.1 میکرولیتر حجم تزریق است، گاهی همین ml0.1 هم برای تزریق به این دستگاه زیاد است پس از سیستمی که برای رقیق کردن نمونه است و split یا spliless نام دارد استفاده می کنیم. Split یعنی چند شاخه شدن یعنی نمونه ای که به دستگاه تزریق می کنیم عدد split را به دستگاه می دهیم .مثلا100،نمونه به همان مقدار تقسیم شده و یکی از آن قسمتها وارد دستگاه می شود.

گاهی نمونه خالص، خیلی غلیظ است و حتی با طریق split خط پایه خوبی ندارد. پس این نمونه ها را رقیق می کنیم (معمولا با متانل) مجبوریم ml 0.2-0.1 از نمونه را تزریق کنیم، چون حجم حلال زیاد و حجم نمونه کم است که در اینجا به مقدار زیاد حلال به دستگاه می رسد که ممکن است فشار زیادی به دستگاه وارد کند، بنابراین به اندازه R_t حلال به دستگاه delay (تاخیر) می دهیم تا فیلاماندستگاه پس از خروج حلال روشن شود، که متانل بعد از 2 دقیقه می آید، یعنی دستگاه 2 دقیقه طیف جرم نمی گیرد.

در Mass احتیاج داریم که مقادیر میکروگرم از نمونه را تحت شرایط خلا بخار نموده و از آن طیف بگیریم . پس نیاز به خلا داریم که توسط توربوپمپ Turbo pump خلا mmHg ^7-10 ایجاد می شود. دو طریق عمده برای یونیزاسیون نمونه داریم: 1- طریقه Electron Ionization الکترون یونیزاسیون (EI): که انرژی حدود ^ev 70 به جسم اعمال می شود. مقدار شکست ها خیلی زیاد است، پس اطلاعات راجع به ساختمان شیمیائی جسم بیشتر می شود. تنها اشکال آن ندیدن پیک یون ملکولی در برخی اوقات است.

2- روش chemical Ionization یونیزاسیون شیمیایی (C.I): از گاز متان، ایزوبوتان، آمونیاک برای شکستن جسم استفاده می کنیم که طریق نرمتری است ولی یون ملکولی را می بینیم.ما به روش EI کار می کنیم.

در شروع کار با دستگاه بایدتشکیل خلا را چک کنیم که به میزان قابل قبولی رسیده باشد به خاطر اینکه وجود آب پیک (18)، ازت (28)، اکسیژن (32) را ایجاد می کنند.با این حال معمولا وقتی طیف Mass می گیریم به آن برنامه می دهیم که از mass 40 به بالا را بگیرد.

لازم است که ماهی یکبار کالیبراسیون را برای دستگاه انجام می دهیم، یعنی از یک جسم استاندارد طیف Mass بگیریم و ببنیم آیا مطابقت دارد یا نه؟ استاندارد: پرفلوروتری بوتیل آمین که در داخل خود دستگاه در داخل یک شیشه کوچک تعبیه شده این جسم دارای پیک های شارپی در نواحی به خصوصی هست، اگر دستگاه بتواند این پیک ها را پیدا کند، در آن صورت اعلام می دارد که آیا دستگاه کالیبره هست یا نه.

مزیت دیگر این دستگاه: امکان جستجو در کتابخانه (Library) دستگاه هست، بعد از گرفتن طیف می توان در کتابخانه دستگاه رفته و search یا جستجو نمود. برای هر گروه از مواد، کتابخانه جداگانه ای وجود دارد. دستگاه 10 کاندید را پیشنهاد می کند.

فاکتور P (purity) درصد احتمال صحت کاندیداها را نشان می دهد که اگر بالاتر از 80% (اعداد بالاتر از 800)  باشد، قابل قیول است.

اگر فاکتور P از 800 به بالا بود، به معنی این است که جسم با احتمال بیش از 80%  همان کاندید است. فرض کنیم پیک جسمی از 3 فراکشن C,B,A تشکیل شده باشد. این دستگاه ضمن اینکه کروماتوگرام را به ما می دهد، طیف Mass را نیز به ما می دهد. یعنی از هر جزء (Fragment) طیف Mass گرفته می شود.

تنها محدودیت این دستگاه این است که چون سیستم وارد کننده نمونه به دستگاه GC, Mass است. پس در واقع تنها موادی را می توان با GC شناسائی نمود که فرار باشند یا از آنها بتوان مواد فرار (توسط مواد مشتق ساز مواد فرار) تهیه کرد. مواد مشتق ساز عبارتند از: مشتقات سیلیس (تری میتل سیلان) که با جسم ایجاد مشتقات فرار قابل تزریق به GC را می نمایند.

قسمتهای مختلف دستگاه:

1- مخزن هلیم: He با خلوص بسیار بالا

2- injector: فلوی گاز حامل را روی Psi 12 تنطیم می کنیم. در قسمت split flow . میزان رقیق شدن نمونه را تعیین می کنیم، یعنی نمونه با گاز حامل تقسیم به نسبت می شود و تنها به نسبت 1به عدد تقسیم وارد ستون می گردد. ممکن است قسمت GC با یک دتکتور FID به عنوان یک بخش مستقل استفاده شود.

3- ستون: از نوع کاپیلری   طول: 30m                      نوع DB-5

بعد از مدتی ستون کثیف می شود که باید آن را مجددا احیاء (رژنره) کنیم، برای این کار مدتی ستون را در دمای ° 215-200 قرار می دهیم تا اشغالها بسوزد. پس از چند بار با این روش هم دیگر نمی توان ستون را احیاء مجدد نمود، و باید cm 20 اول ستون را قطع نمود، چرا که اغلب اشغالها در cm 20 اول ستون هستند.

4- detector( دتکتور همان دستگاه Mass می باشد.

5- Recorder

6- برای قسمت Mass احتیاج به پمپ برای ایجاد خلا داریم

برای کار با دستگاه : ابتدا وارد بخش Instrumental control می شویم که در اینجا میزان آب و هوا را مشاهده می کنیم. سپس calibration Mass انجام می شود که پیکهای استاندارد پیدا شده و منحنی استاندارد رسم می شود. اگر در هر بخش اشکالی ایجاد شود، در بخش Diagnostics اشکال را پیدا می کنیم.

سپس در بخش analysis موارد زیر تعیین می شود:

نام فایل مشخص می شود. 1- Data file

پارامترهایی مثل: دما، زمان و... مشخص می شود 2-GC Method

مشخصات فوق می تواند توسط فرد تعیین شود (با Edit) و یا پیش فرضهای دستگاه پذیرفته شود با فشار دادن کلید C، می توان کروماتوگرام ترکیب را بدست آورد و با کلید F₁ از هر محل دلخواه کروماتوگرام به طیف Mass را بدست آورد.

همچنین در بخش Chrome analysis می توان کروماتوگرام ماده را مشاهده کرد، بخشی از آن را بزرگ کرد و از هر قسمت دلخواه طیف Massرا بدست آورد.

پس از رسم طیف Mass با فشار دادن کلید L وارد کتابخانه (Library) دستگاه می شویم که
می توان در این بخش ترکیب را در کتابخانه موردنظر (مثلا  Libraryترپنوئیدها، و ...) جستجو Search نمود. همانطور که گفته شد فقط انتخابهایی که purity بالاتر از 800  قابل قبول می باشد. در نهایت خاموش کردن دستگاه را می توان بصورت دستی (manual) انجام داد یا از قسمت shut down استفاده نمود که انجام مراحل خاموش کردن دستگاه، چند ساعت طول
می کشد********

اساس کار با دستگاه

به ازای تعداد فراکسیونهای موجود در اساس در کروماتوگرام پیک ظاهر می شود. در کروماتوگرام محور Xها مشخص کننده R_t و محور yها تعیین کننده شدت پیک هاست، طوری که با اندازه گیری AUC می توانیم تعیین مقدار کنیم و نیز با R_t شناسایی کیفی انجام می دهیم.

تفاوت این دستگاه با GC اینست که در اینجا از هر فراکسیون در دستگاه Mass طیف جرم گرفته می شود. در این طیف های جرم پیک ها تک شاخه ایست. فراوانی Base peak ، 100% است و بلندترین پیک انتهایی پیک یون مولکولی می باشد. بعد از انتخاب پیک مربوط به هر فراکسیون در طیف کروماتوگرام تعیین (scan number)، دستگاه طیف جرم مربوط به آن را رسم کرده سپس طیف جرم را به کتابخانه دستگاه برده و برحسب درصد انطباق برای هر طیف 10 تا کاندیدا می دهد.

در این دستگاه GC و Mass از هم جدا نمی شود و طرز وارد کردن نمونه به دستگاه Mass  از طریق GC می باشد، بنابراین در این دستگاه، فقط از نمونه هایی می توانیم طیف جرم تهیه کنیم که بتوانیم به GC تزریق نمائیم. پس به طور عمده این دستگاه برای شناسایی و تعیین مقدار فراکسیونهای اسانس هاست که مواد فرار هستند.

ستون دستگاه GC از نوع لوله موئینه است زیرا باید حجم نمونه کم باشد تا طیف جرمی خوبی به دست آید. برای کاهش حجم نمونه چند کار انجام می شود: یک راه رقیق کردن اسانس با حلال (معمولا متانول) است و یا می توان به جای تزریق، فقط سرسوزن را به اسانس آغشته نمود. اما بازهم گاه مشاهده می شود که تنها با رقیق کردن، پیک ها از صفحه بیرون می زند. به همین منظور در دستگاه سیستم Split  طراحی شده که این سیستم آنچه را که از طریق injector وارد دستگاه می شود، تقسیم می کند و یک قسمت را وارد ستون کرده و بقیه را از پشت دستگاه خارج می کند که براساس میزان فلویی که ما برای دستگاه مشخص می کنیم این تقسیم صورت می گیرد که حداکثر آن معمولا 300/1 است.

برای شروع کار با دستگاه روش کار با دستگاه، باید مطمئن شویم که در دستگاه خلا برقرار شده زیرا باید طیف جرم را در خلا بگیریم. سپس باید دستگاه را کالیبره کنیم. به این منظور از ماده پرفلوئورو تری بوتیل آمین استفاده می کنیم.

دستگاه این ماده را با FC-43 می شناسد. این ترکیب دارای 6 پیک مشخص است و اگر این پیک ها سرجایشان بودند یعنی دستگاه درست کار می کند. این ماده را ما به دستگاه تزریق نمی کنیم، بلکه به دستگاه برنامه ای می دهیم تا براساس این ماده کالیبره شود، یعنی قبل از شروع هر کاری وقتی مطمئن شدیم خلا برقرار شده یک برنامه به دستگاه می دهیم تا از استاندارد استفاده کند.

در مرحله بعد باید متدهای GC و Mass را مشخص کنیم.

متدی که برای GC انتخاب می کنیم ESS است. این متد ترکیبی ازمتد ایزوترمال به مدت min 10 و بعد پروگرامیک  است که در آن دمای شروع و اتمام کار مشخص است. در متدی که برای Mass انتخاب می کنیم Mass range مشخص می شود که معمولا این محدود را از 40 تا 300 می گیریم. زیرا در محدوده کمتر از 40 پیک نداریم و نیز در این جا مزاحمت هایی هم وجود دارد. در متد Mass یک مدت زمان تاخیر (delay time) هم در نظر می گیریم، در این مدت فقط حلال (متانول) از دستگاه خارج می شود و طیف جرم آنرا نمی گیریم بنابراین در دو دقیقه اول پیکی رسم نمی شود. علت این کار اینست که تعداد مولکول های متانول نسبت به جرم ماده نمونه زیاد است که اگر طیف جرم آن را بگیریم فشار زیادی به دستگاه می آید.

در متد Mass روش گرفتن طیف جرم (Ionization mode) را هم مشخص می کنیم. به طور کلی دو روش وجود دارد EI(Electron Ionization) و CI(Chemical Ionization) که ما در این جا از روش EI استفاده می کنیم.شکسته شدن به روش EI شدیدتر از CI است و در این روش طیف های بیشتری مشاهده می شود زیرا شکست ها بیشتر است و ممکن است یون مولکولی مشاهده نشود.

ستون دستگاه با اسم تجارتی DB-5، دارای پلاریته متوسط بوده و در آن از گاز هلیوم به عنوان حامل استفاده می شود. (در اینجا از گاز ازت برای شکستن خلا استفاده می کنیم). اگر ببنیم کیفیت ستون کاهش یافته (به علت چسبیدن ماده به آن کارایی کم شده باشد) 10-20 سانتی متر اول ستون را قطع می کنیم. ستون از یک طرف به سیستم تزریق و از طرف دیگر به دتکتور وصل است. می توان تا 300 فلواسپلیت داشته باشیم. آنچه به ستون تزریق می شود با گاز حامل مخلوط شده و بعد تقسیم می شود.

در قسمت Instrumental control باید چک کنیم که در قسمت خلا آب و هوا نباشد بعد وارد قسمت آنالیز شده و متدهای مورد نظر را به دستگاه download می کنیم. سپس باید منتظر بمانیم تا دستگاه GC  گرم و آماده شود. وقتی چراغ GC روشن شد آماده تزریق خواهد بود. در اینجا مدت تزریق 70 دقیقه طول می کشد. هر چه طیف جرم را با غلظت کمتر بگیریم. طیف بهتری خواهیم داشت مثلا اگر فراکسیون A در بین دقیقه های 3تا5 بیرون آمده در هر ثاینه آن یک طیف جرم گرفته می شود و معمولا طیف جرم از راس پیک با ابتدا و انتهای پیک متفاوت است زیرا در قسمت راس غلظت فراکسیونها بیشتر است. غلظت بیشتر باعث شلوغ شدن طیف جرم می شود. بنابراین از طیف های جرم پای پیک یعنی با scan number پائین تر برای بردن به کتابخانه استفاده می کنیم.

در دستگاه کتابخانه های مختلفی برای جستجو وجود دارد که کتابخانه ترپن ها بهترین کتابخانه برای جستجوی اسانس هاست. (البته کتابخانه های بزرگ دیگری هم وجود دارد).گاه نتایج بسیار متنوعی با جستجو در کتابخانه های مختلف مشاهده می شود. معیار قبول کردن کاندیداها فاکتور purity می باشد که حداکثر آن 1000 است و نشاندهنده انطباق 100% می باشد. معیار قبولی کاندیدا purity برابر 800 را انطباق 80% است. و معمولا سه کاندیدای اول اهمیت بیشتری دارند یادداشت می شوند.

منبع: وب شیمی www.WebShimi.ir

منگانومتری

منگانومتری :

منگانومتری به دسته ای از تیتراسیونهای اکسایش کاهش گفته می شود که در آنها واکنش اکسیداسیون با پتاسیم پرمنگنات انجام می شود یعنی در این روش از محلول استاندارد پتاسیم پرمنگنات استفاده می شود.

شرح آزمایش:

ابتدا بورت را با آب مقطر بشویید. سپس آن را با پتاسیم پر منگنات KMnO4  شست وشو دهید وپس ازشست وشو آن را تا صفر پر از پتاسیم پرمنگنات کنید. سپس حدود ١٠ میلی لیتر اگزالیک اسید را داخل ارلن ریخته و به آن ١٠ میلی لیتر سولفوریک اسید N4 اضافه کنید. ارلن را تا ٦٠ درجه سلسیوس حرارت بدهید. 

حال ارلن را زیر بورتی که به پایه وصل است قرار داده و در حالی که با دست چپ شیر بورت را باز می کنید تا قطره قطره پتاسیم پرمنگنات که رنگ ارغوانی پر رنگی را دارد درون ارلن بریزد، با دست راست ارلن را به صورت دورانی به حرکت در می آوریم  مشاهده کردیم که پس از چند میلی لیتر مصرف پتاسیم پرمنگنات رنگ صورتی در مایع بوجود آمد. دقت شود که هنگامی که ارلن  را می خواهید زیر بورت قرار دهید نباید زیاد گرم باشد .پس از مصرف ١٠ میلی لیتر رنگ صورتی پایداری در محلول بوجود آمد. 

حال می توانیم نرمالیته پرمنگنات پتاسیم را محاسبه کنیم :

 جرم سدیم اگزالات     [NA2C2O4] .134g

عدد اکسایش

مفهوم عدد اکسایش

اعداد اکسایش بارهایی (در مورد ترکیبات کووالانسی ، بارهایی فرضی) هستند که بر طبق قواعدی اختیاری به اتم‌های یک ترکیب نسبت داده می‌شوند. عدد اکسایش یونهای تک اتمی ‌، همانند بار آن یونهاست.

قوانین تعیین اعداد اکسایش

این قوانین باید ساده و روشن باشند و در صورت امکان نتایج مستدلی از نظر شیمیایی ارائه داده و ابهامی‌ نداشته باشند. این قواعد را که عموما پذیرفته شده‌اند، باید به همان ترتیبی که ارائه شده است، بکار برد. اعمال این قوانین برای تعیین اعداد اکسایش ترکیبات معدنی محکی از اظهارات فوق است. عدد اکسایش یونهای تک اتمی‌، همانند بار آن یونها است.

عدد اکسایش اتم‌های یک ترکیب کووالانسی را می‌‌توان با نسبت دادن الکترونهای هر پیوند به اتم الکترونگاتیوتر درگیر در پیوند بدست آورد. در مورد اتم‌های همانند که بین آنها یک پیوند غیرقطبی وجود دارد و الکترونهای پیوند به تساوی بین این اتمها تقسیم شده‌اند، عدد اکسایش صفر است.

قاعده/کاربرد	عدد اکسایش
جمع اعداد اکسایش همه اتمهای موجود در گونه‌ها برابر با بار کلی گونه مربوطه است.
برای اتمها در شکل عنصری	0
برای عناصرگروه I	1+
برای عناصرگروه II	2+
برای عناصرگروه III (به‌غیر از B	3+ برای M+3 و 1+ برای M+1
برای عناصرگروه IV (به‌غیر از C و Si	4+ برای M+4 و 2+ برای M+2
برای هیدروژن	1+ در ترکیب با غیرفلزات و 1- در ترکیب با فلزات
برای فلوئور	1- در همه ترکیبات
برای Cl , Br , I	1- مگر در ترکیب با اکسیژن
برای اکسیژن	2- مگر در ترکیب با F ، 1- در پروکسیدها (O-22) ، 2/1- در سوپروکسیدها (O-2) ،3/1- در اوزونیدها (O-3)

در مواجهه با مولکول آلی و مثالهایی از جمله زنجیری شدن ، آب‌زدایی ، اکسایش و شروع با این قواعد را تشریح می‌کنند. آنچه باعث نگرانی می‌شود، عبارت است از:

·      زنجیری شدن، به عنوان یک واکنش اکسایش ـ کاهش ظاهر می‌‌شود.

·      عدد اکسایش اتم های کربن در هیدروکربنها 5 واحد اختلاف دارد، از 4- در تا صفر در

·      عدد اکسایش اتم کربن ، هنگامی ‌که از به می‌‌رویم، 8 واحد تغییر می‌‌کند.

·      عدد اکسایش اتم کربن موجود در متانول 2- ، در همه انواع الکلهای نوع اول 1- ، در الکل نوع دوم  0، و در الکل نوع سوم 1+ است.

·      آب‌دهی و آب‌زدایی هیدروکربنها مفهوم یکسانی از واکنش‌های اکسایش ـ کاهش هستند، همانند تشکیل الکل یا هالید.

·      عدد اکسایش هیدروژن در پیوند با اکسیژن و با اتم کربن یکسان است

جدول شناساگرهای رایج اسید-باز

شناساگر	محدوده pH	مقدار در هر 10 سی سی	رنگ محیط اسیدی	رنگ محیط بازی
Thymol Blue	1.2-2.8	1-2 drops 0.1% soln. in aq.	قرمز	زرد
Pentamethoxy red	1.2-2.3	1 drop 0.1% soln. in 70% alc.	قرمز-بنفش	بیرنگ
Tropeolin OO	1.3-3.2	1 drop 1% aq. soln.	قرمز	زرد
2,4-Dinitrophenol	2.4-4.0	1-2 drops 0.1% soln. in 50% alc.	بیرنگ	زرد
Methyl yellow	2.9-4.0	1 drop 0.1% soln. in 90% alc.	قرمز	زرد
Methyl orange	3.1-4.4	1 drop 0.1% aq. soln.	قرمز	نارنجی
Bromphenol blue	3.0-4.6	1 drop 0.1% aq. soln.	زرد	آبی-بنفش
Tetrabromphenol blue	3.0-4.6	1 drop 0.1% aq. soln.	زرد	آبی
Alizarin sodium sulfonate	3.7-5.2	1 drop 0.1% aq. soln.	زرد	بنفش
α-Naphthyl red	3.7-5.0	1 drop 0.1% soln. in 70% alc.	قرمز	زرد
p-Ethoxychrysoidine	3.5-5.5	1 drop 0.1% aq. soln.	قرمز	زرد
Bromcresol green	4.0-5.6	1 drop 0.1% aq. soln.	زرد	آبی
Methyl red	4.4-6.2	1 drop 0.1% aq. soln.	قرمز	زرد
Bromcresol purple	5.2-6.8	1 drop 0.1% aq. soln.	زرد	ارغوانی
Chlorphenol red	5.4-6.8	1 drop 0.1% aq. soln.	زرد	قرمز
Bromphenol blue	6.2-7.6	1 drop 0.1% aq. soln.	زرد	آبی
p-Nitrophenol	5.0-7.0	1-5 drops 0.1% aq. soln.	بیرنگ	زرد
Azolitmin	5.0-8.0	5 drops 0.5% aq. soln.	قرمز	آبی
Phenol red	6.4-8.0	1 drop 0.1% aq. soln.	زرد	قرمز
Neutral red	6.8-8.0	1 drop 0.1% soln. in 70% alc.	قرمز	زرد
Rosolic acid	6.8-8.0	1 drop 0.1% soln. in 90% alc.	زرد	قرمز
Cresol red	7.2-8.8	1 drop 0.1% aq. soln.	زرد	قرمز
α-Naphtholphthalein	7.3-8.7	1-5 drops 0.1% soln. in 70% alc.	گلی	سبز
Tropeolin OOO	7.6-8.9	1 drop 0.1% aq. soln.	زرد	گلی-قرمز
Thymol blue	8.0-9.6	1-5 drops 0.1% aq. soln.	زرد	آبی
Phenolphthalein	8.0-10.0	1-5 drops 0.1% soln. in 70% alc.	بیرنگ	قرمز
α-Naphtholbenzein	9.0-11.0	1-5 drops 0.1% soln. in 90% alc.	زرد	آبی
Thymolphthalein	9.4-10.6	1 drop 0.1% soln. in 90% alc.	بیرنگ	آبی
Nile blue	10.1-11.1	1 drop 0.1% aq. soln.	آبی	قرمز
Alizarin yellow	10.0-12.0	1 drop 0.1% aq. soln.	زرد	یاسی
Salicyl yellow	10.0-12.0	1-5 drops 0.1% soln. in 90% alc.	زرد	نارنجی-قهوه ای
Nitramine	11.0-13.0	1-2 drops 0.1% soln in 70% alc.	بیرنگ	نارنجی- قهوه ای
Poirrier’s blue	11.0-13.0	1 drop 0.1% aq. soln.	آبی	بنفش-صورتی
Trinitrobenzoic acid	12.0-13.4	1 drop 0.1% aq. soln.	بیرنگ	نارنجی-قرمز