رقیق سازی

آزمایش: رقیق سازی

هدف آزمایش: رقیق سازی نمونه ها برای کاهش بار میکروبی و شمارش بهتر میکروب ها



به نام خدایی که عاشقم فرمود از برای علم

مقدمه:

آماده سازی نمونه و تهیه رقت های مختلف

v آماده نمودن نمونه های مختلف:

§ نمونه‌های منجمد و فریز: نمونه‌های منجمد قبل از آزمایش به یکی از دو روش زیر دیفراست و سپس از آن ها رقت ها ساخته می ‌شود.

الف) نمونه به مدت 18 تا 24 ساعت در دمای یخچال 2 تا 5 درجه سانتیگراد.

ب) نمونه‌ای که به سهولت از انجماد خارج می شود بمدت 15 دقیقه در دمای 35 درجه سانتیگراد.

§ نمونه‌های غذایی مایع: قبل از آزمایش و تهیه رقت به خوبی تکان داده و هموژن و یکنواخت گردد و در زمان باز کردن در ظرف باید از آلوده شدن آن اجتناب شود لذا باید آن ناحیه قبلاً ضد عفونی شود.

§ نمونه‌های غذاهای بسته بندی شده مانند ظروف و قوطی های کنسرو و غیره باید سطوح خارجی و محل باز کردن توسط شعله و یا الکل و یا هوای داغ ضد عفونی گردد.

§ مواد غذایی خشک و پودری نیز با دقت ناحیه خاص کوچکی از آن جهت برداشت بازگردد.

v در تهیه رقت‌ها رعایت شرایط استریل الزامی بوده و در خرد و یکنواخت و هموژن کردن نمونه با رقیق کننده ها چنانچه از مخلوط کن یا استوماکر استفاده می شود باید سعی شود تا از آسیب های مکانیکی و گرمای ایجاد شده با کم کردن مدت هموژنیزاسیون از آن جلوگیری نمود ضمناً از مواد غذایی جامد و نیمه جامد مانند گوشت مرغ ماهی و فرآورده های آن پنیر و غیره در صورت لزوم از قسمتهای خارجی، میانی و عمقی برداشت شود تا درتفسیر نتایج مشکلی پیش نیاید. جهت باز کردن قوطی های کنسرو باید یک قیف واژگون استریل را متناسب با در قوطی در آن گذارده و سپس یک میله فلزی استریل بلندی را در جهت باریک قیف داخل کرده و توسط ضربه قوطی را سوراخ نمود.

v ترکیب رقیق کننده‌ها: مهم ترین رقیق کننده‌ها شامل آب نمک 5/8 در هزار (سرم فیزیولوژی) بافرها فسفاته و محلول رینگر 4/1 است ولی چون این محلول ها در زمان طولانی برای میکرو ارگانیسم‌ها زیان آور است لذا بهتر است از رقیق کنند‌هایی که کمتر برای میکرو ارگانیسم‌ها زیان آور است استفاده شود که بهترین آن ها آب پیتونه 1/0 می باشد اینک جهت آگاهی به ترکیب و نحوه ساخت رقیق ‌کننده‌های مهم اشاره می‌شود.

§ محلول رینگر 4/1: کلرید سدیم 9 گرم + کلرید پتاسیم 42/0 گرم + کلرید کلسیم 48/0 گرم+ بی کربنات سدیم 24/0 گرم در حجم 4 لیتر آب مقطر که در دمای 121 درجه سانتیگراد به مدت 10 دقیقه استریل می ‌گردد، pH محلول نهایی باید 7 باشد.

§ آب پیتونه: پیتن 10 گرم + کلرید سدیم 5 گرم در حجم یک لیتر با آب مقطر کهpH در 7 تنظیم گردد و سپس در دمای 121 درجه سانتیگراد به مدت 15 دقیقه استریل گردد.

§ محلول بافر فسفات ذخیره : 34 گرم دی هیدروژن فسفات پتاسیم + 500 میلی لیتر آب مقطر که محلول به کمک سود نرمال pHآن بر روی 7 تنظیم گردد و سپس با آب مقطر حجم به یک لیتر رسانده و در دمای 121 درجه سانتیگراد به مدت 15 دقیقه استریل گردد، حال جهت تهیه محلول رقیق شده بافر فسفات 25/1 میلی لیتر از بافر فسفات ذخیره را با آب مقطر به حجم یک لیتر می‌ رسانند و سپس در دمای 121 درجه سانتیگراد به مدت 10 دقیقه استریل می‌ نمایند.

§ سرم فیزیولوژی: مقدار 5/8 گرم کلرید سدیم خالص را با آب مقطر به حجم یک لیتر رسانده و در دمای 121 درجه سانتیگراد به مدت 10 دقیقه استریل می‌ نمایند.

v تهیه رقت‌های اعشاری: معمولا 10 گرم از نمونه مورد آزمایش را با 90 میلی لیتر رقیق کننده در استوماکر به صورت سوسپانسیون درآورده که جهت این عمل ابتدا مخلوط کن با سرعت کم و تدریجا به مدت 1 تا 2 دقیقه با سرعت بالا عمل مخلوط کردن را ادامه می ‌دهند تا مخلوط یکنواختی از نمونه با رقت 10/1 به دست آید. برای رقت‌های بعدی تعداد لازم لوله ‌های آزمایش حاوی 9 میلی لیتر مایع رقیق کننده را به ترتیب با برداشت یک میلی لیتر از رقت 10/1 و افزودن به اولین لوله رقت 100/1 به دست خواهد آمد سپس یک میلی لیتر از رقت 100/1 به لوله دوم اضافه کرده رقت 1000/1 حاصل شده و به همین ترتیب رقت های بعدی در صورت نیاز ساخته خواهد شد.



گزارش کار: عمل رقت در مقیاس 4-10 به وسیله ی سه نمونه ی شیر، نوشابه، کیک

در این آزمایش سه نمونه ی شیر، نوشابه و کیک در اختیار گروه ها قرار گرفته و نمونه ی شیر برای این گروه تعیین شده است. در فرایند رقت سازی نمونه ها، باید نمونه ها آماده شوند (همگن شوند) که این عمل در نمونه های جامد با پودر کردن و در نمونه های مایع با تکان دادن و به لرزش در آوردن نمونه انجام می شود.

نمونه ی شیر نیز به عنوان مایع تکان داده شده تا همگن شود (در نمونه ی نوشابه برای از بین بردن گاز موجود در آن، مقداری از نمونه را در لوله ی آزمایش قرار داده و بوسیله ی دستگاه شیکر، گاز آن را خارج می کنیم. نمونه ی کیک نیز باید بوسیله ی هاون کوبیده شود).

· قابل توجه است که باید عمل رقیق سازی در محیطی استریل انجام شود و قبل از انجام آزمایش محیط و ابزار را بوسیله ی الکل استریل کرد. این آزمایش نیز باید در کنار شعله انجام شود.

حال ارلنی برداشته و در آن 10 میلی لیتر از نمونه ی شیر را قرار داده و سپس 90 میلی لیتر آب مقطر که به عنوان یک مایع رقیق کننده است به آن اضافه می شود (اندازه گیری آب مقطر به وسیله ی استوانه ی مدرج و نمونه ی مایع بوسیله پیپت و پوار با توجه به سطح برداشت و نمونه ی جامد به وسیله ترازو انجام می شود). سپس نمونه و آب مقطر را تکان داده تا ترکیب شود (پس از ترکیب کردن نمونه ی جامد با آب مقطر ابتدا باید صبر کرد تا مواد جامد و پودری رسوب کند و سپس از قسمت شفاف نمونه استفاده کرد) حال نمونه ی رقت 1-10 را آماده کرده ایم.

حال به وسیله ی پیپت و پوار 1 میلی لیتر از نمونه و 9 میلی لیتر آب مقطر را برداشته و در یک لوله ی آزمایش قرار می دهیم و تکان می دهیم که رقت 2-10 را تهیه کرده ایم. حال از رقت حاضر طبق روش قبل رقت 3-10 و از رقت جدید، رقت 4-10 را تهیه می کنیم. ادامه این روند رقت های بعدی را نیز بدست می دهد.



نتیجه:

در عمل رقیق سازی زمانی که نمونه ی رقت شده را بر روی پلیت کشت می دهیم، پس از عمل کشت و نمایان شدن کلونی ها، تعداد باکتری های نمونه اصلی را اندازه گیری می کنیم که با روش زیر محاسبه می شود:

عکس رقت x تعداد باکتری های موجود در رقت مورد آزمایش = تعداد باکتری های نمونه اصلی

مثال: اگر 3 کلونی بر روی پلیت نمایان شود، تعداد باکتری ها در رقت 4-10 برابر است با 410 x3 می باشد.



خطای آزمایش:

خطای این آزمایش زمانی است که نمونه ها را برداشت می کنیم روی می دهد و احتمال برداشت کمتر و بیشتر نمونه ها وجود دارد که می تواند تاثیری بر آزمایش داشته باشد.

منبع: www.arm1354.blogfa.com

پایان

به پایان آمد این دفتر حکایت هم چنان باقیست