آماده سازی محیط کشت

آزمایش: آماده سازی محیط کشت

هدف: فراهم آوری محیط کشت باکتری ها برای آزمایشات

به نام خدایی که کائنات را برای انسان معما ساخت

مقدمه:

روش تهیه محیط های کشت :

مطابق دستور کارخانه سازنده و با توجه به بروشور الصاقی روی آن می توان مقدار لازم از محیط کشت که به صورت پودری یا پلیت شده می باشد را برداشته و با مقدار توصیه شده آب مقطر در داخل ارلن مخلوط کنید بعد آن را با توجه به دستور کارخانه اگر لازم بود روی شعله قرار داده تا بر اثر حرارت شفاف شود که البته در بعضی از محیط ها نیازی به این کار نیست. بعد آن را در اتوکلاو قرار داده و به مدت 15 دقیقه در دمای 121 درجه سانتیگراد قرار می دهید تا استریل شود. بعضی از محیط های کشت که به دمای بالا حساس می باشند در اتوکلاو قرار نمی گیرند و این مسئله را کارخانه سازنده حتما متذکر شده است. بعد از اتوکلاو گذاری محیط های کشت آگار دار داخل ارلن سفت می شود و برای استفاده از آن ها باید دوباره حرارت داده شوند ولی محیط های کشت مایع به شکل مایع باقی می مانند و آماده مصرف هستند.


گزارش کار: آماده سازی محیط کشت (پلیت کانت آگار (plate count agar (pca)))

به طور معمول آماده سازی از طریق اطلاعاتی که بر روی ظرف و بسته بندی محیط های کشت درج شده است استفاده می شود. ابتدا مقدار تعیین شده محیط کشت را با ترازو اندازه گیری کرده و در یک ارلن با مقدار یک لیتر آب مقطر ترکیب می نماییم. (بری محیط کشت pca مقدار 23.5 گرم در حجم یک لیتر آب مقطر در نظر گرفته شده است که این عمل را در آزمایشگاه با مقدار 5.8 گرم pca و 250 میلی لیتر آب مقطر در ارلنی با حجم 250 میلی لیتر ترکیب می کنیم(. عمل ترکیب سازی توسط یک همزن شیشه ای انجام می شود و تا آن جایی پیش می رود که ترکیب موجود در ارلن کاملا یکنواخت گردد و برای بهتر حل شدن نیز می توان ارلن را در بن ماری (حمام آب گرم) قرار داد. توجه داشته باشید که در زمان تقابل نمونه ی موجود در ارلن و حرارت، باید نمونه مرتب هم زده شود. سپس ارلن را پس از ترکیب سازی نمونه موجود را برداشته و بوسیله ی تکه ای فویل آلومینیومی و پنبهی استریل سر ارلن را میبندیم و در اتوکلاو استریل می نماییم. شرایط اتوکلاو نیز برای استریلیزاسیون باید مطابق با شرایط زیر باشد:

دما: 121 درجه سانتیگراد / زمان: 15 دقیقه / فشار: 1.2atm، 1.2bar، 15pb/inch2

· تنظیم فشار در دستگاه اتوکلاو به طور خودکار زمانی که شرایط دیگر مساعد و درست باشد، تنظیم می گردد.

در محیط کشت مایع (broth)، مراحل اولیه مطابق شرایط بالا طی شده و در زمان هم زدن ابتدا در لوله های آزمایش به نسبت های مساوی ریخته شده و سپس در بن ماری برای ترکیب سازی قرار می گیرد. لوله های آزمایش سرشان با استفاده از پنبه و فویل آلومینیومی بسته شده و در اتوکلاو با توجه به شرایط مناسب کشت استریل می شود.

پس از عمل استریلیزاسیون، نمونه ی موجود در اتوکلاو (نمونه کاملا شفاف می شود) در پلیت ریخته شده و باکتری ها را روی آن کشت می دهیم. محیط های کشت مایع نیز به همین صورت از طریق لوله های آزمایش به پلیت منتقل می شود.



روش کار دستگاه اتوکلاو:

دستگاه اتوکلاو، دستگاه حرارت مرطوب (بخار آب) می باشد و دارای یک مخزن داخلی می باشد که در این مخزن سه پایه بر روی جداره ی آن تعبیه شده و دیگی آلومینیومی بر روی آن ها و دستگاه اتوکلاو قرار می گیرد. که در این دیگ نمونه ی آزمایش جای داده می شود. در مخزن زیرین آب قرار می گیرد تا با استفاده از حرارت دادن و بخار آب شرایطی مناسب برای استریل اتفاق بیافتد. قابل توجه است که آب موجود در اتوکلاو باید در سطحی زیر سه پایه ی موجود باشد. سپس با قرار دادن نمونه در دیگ آلومینیومی و قرار دادن دیگ بر روی پایه ها، درب اتوکلاو را بسته و پیچ های آن را محکم می کنیم و سپس از طریق قسمت تنظیمات شرایط را برای استریل تنظیم می کنیم.

تنظیم کردن اتوکلاو: پس از روشن کردن دستگاه، ابتدا دکمه ی mode را فشار داده و سپس از طریق دکمه های جهت بالا و پایین دما را تنظیم می کنیم و دکمه ی save را می زینم حال زمان را تنظیم می کرده و دوباره دکمه ی save را می زنیم و سپس دکمه ی mode و دستگاه شروع به کار می کند.

پس از شروع کار چراغ heather (قرمز رنگ) روشن و چراغ wk (آبی رنگ) که نشان دهنده ی میزان مناسب آب (water ok) نیز روشن می شود. پس از رسیدن دستگاه به حد مناسب، چراغ streal (زرد رنگ) روشن می شود و زمان تعیین شده به کار می افتد و زمانی که به صفر می رسد، دکمه end (سبز رنگ) روشن می شود.

بر روی درب دستگاه اتوکلاو، یک خروجی تخلیه ی بخار وجود دارد که بعد از عمل استریل آرام آرام آن را باز کرده تا فشار موجود در دستگاه خارج شود (نشان گر فشار بخار دستگاه بر روی درب آن قرار دارد) و به صفر برسد، پس از به صفر رسیدن صبر می کنیم تا زمانی که دما به 95 درجه سانتی گراد برسد و حال می توان درب را باز کرده و نمونه را بیرون بیاوریم و از آن استفاده کنیم.(صبرلازم برای خارج کردن نمونه جهت پیش گیری از سوختن و کاهش دمای زیاد نمونه می باشد)

نتیجه:

یادگیری روند آماده سازی محیط کش از ملزومات آزمایشات میکروبی که در این سطح انجام می شود، می باشد و مرحله ای مهم در کشت و پرورش میکروب ها می باشد.

خطای آزمایش:

اندازه گیری نا مناسب میزان تعیین شده ی مواد و هم چنین تنظیم نا صحیح دستگاه اتوکلاو و ترکیب نا صحیح نمونه موجب اختلال در روند آماده سازی محیط کشت می شود.

· توجه کنید که این آزمایش نیز مانند تمام آزمایشات میکربیولوژی باید در شرایط استریل انجام شود.

منبع: www.azmayeshat.mihanblog.com