روش کشت صفحه ای سطحی(روش پخش قطره ای)
الف: لوازم مورد نیاز:
1. برای آماده سازی نمونه و تهیه رقت از ماده غذایی همگن شده استفاده می شود.
2. پلیت های شیشه ای (10 x 15 mm) یا پلاستیکی (9 x 15 mm)
3. پیپت های باکتریولوژی به اندازه های 1، 5 و 10 میلی لیتر
4. حمام آب گرم یا گرمخانه دارای تهویه جهت گرم نگه داشتن محیط کشت در حرارت 46-44 درجه سانتی گراد
5. گرمخانه 31-2 درجه سانتی گراد (توجه: ثبات و یکنواختی درجه حرارت گرمخانه همیشه یکسان نیست). برای کنترل ثبات درجه حرارت گرمخانه به وسیله ترموکوپل یا گرماسنج های مناسب در ساعات مختلف و متعدد حرارت داخلی گرمخانه را به طور مکرر اندازه گیری کنید. برای کنترل یکنواختی حرارت در ساعات مختلف باید حرارت نقاط مختلف گرمخانه را هنگامی که پر از پلیت های کحشت است اندازه گرفت. ستون های پتری دیش را در داخل گرمخانه باید با فاصله مناسب از یکدیگر و از دیواره ها و سقف گرمخانه قرار داد. (هر ستون نباید از پیش از شش پتری دیش و ترجیحا 4 عدد تشکیل شده باشد).
6. پرگنه شمار
7. محیط کشت پلیت کانت آگار یا محیط کشت استاندارد متد آگار
8. محفظه خشک کن یا گرمخانه برای خشک کردن سطح محیط های کشت که ترجیحا در 50 در جه سانتی گراد انجام می گیرد.
9. پخش کننده های شیشه ای (میله های شیشه ای سرعصایی شکل)
10. پیپت مدرج باکتریولوژیک به حجم یک میلی متر با درجه بندی 1/0 میلی لیتر یا کمتر
ب: روش:
1. 15 میلی لیتر از محیط ذوب شده و خنک شده (45-60 درجه سانتی گراد) پلیت کانت آگار را به هر پلیت افزوده و بگذارید تا جامد شود. پلیت های حاوی محیط کشت را به مدت 5/1 تا 2 ساعت در حرارت 50 درجه سانتی گراد قرار دهید تا خشک شوند. اگر پلیت ها قبلا آماده شده است، نباید بیش از 24 ساعت در حرارت اتاق یا 7 روز در یخچال 5-2 درجه سانتی گراد نگهداری شوند.
2. مقدار 1/0 میلی لیتر از هر رقت نمونه ماده غذایی آماده شده را به وسیله یک پیپت یک میلی لیتری برداشته و به سطح محیط کشت منتقل کنید. (حداقل از سه رقت استفاده نمایید) از بالاترین رقت شروع کرده و ادامه دهید. قبل از انتقال 1/0 میلی لیتر نمونه سه بار پیپت را پر و خالی کنید، در این صورت در طول مراحل کشت فقط از یک پیپت استفاده نمایید.
3. با استفاده از میله شیشه ای پخش کننده به سرعت مقدار 1/0 میلی لیتر نمونه رقیق شده را در سطح محیط کشت پخش کنید (برای هر پلیت از یک میله شیشه ای مجزا استفاده نمایید) بگذارید که سطح پلیت ها برای 15 دقیقه خشک شوند.
4. پلیت ها را به طور وارونه در گرمخانه (انکوباتور) قرار دهید. (31-29 درجه سانتی گراد به مدت 3 روز)
5. شمارش کشت سطحی:
الف: دو پلیت از یک رقت را که دارای 30 تا 300 پرگنه است انتخاب کرده و با استفاده از پرگنه شمار تمام پرگنه ها را شمارش کنید. میانگین حسابی دو شمارش را که در ضریب رقت ضرب کرده اید را محاسبه کنید و عدد حاصل را به عنوان شمارش کلی میکروب ها گزارش نمایید.
ب: در این روش حتما باید دو پلیت شمارش شوند، حتی اگر یکی از آن ها دارای کمتر از 30 یا دیگری بیش از 300 پرگنه باشد.
ج: اگر دو رقت متوالی دارای 300 – 30 پرگنه باشند، برای هر کدام از رقت ها پرگنه ها را شمارش و میانگین دو رقت را مطابق آنچه گفته شد بدست می آورید، مگر این که پرگنه های رقت بالاتر ، بیش از دو برابر رقت پایین تر باشد. در این صورت شمارش پرگنه در رقت پایین تر را به عنوان شمارش کلی میکروبی گزارش کنید:
6. محاسبه تخمینی شمارش کلی میکروبی
الف: اگر پرگنه های هر پلیت بین 30 تا 300 عدد نباشد، شمارش را به عنوان تخمین شمارش کلی گزارش و به شرح زیر محاسبه کنید:
ب: اگر در تمام رقت ها بیش از 300 پرگنه در هر پلیت دیده شود، سطح هر پلیت را به شعاع های مناسب تقسیم و پرگنه ها را در یک قسمت یا بیشتر شمارش کنید، سپس تعداد کل را در ضریب مناسب ضرب نمایید. میانگین شمارش را در دو پلیت محاسبه کرده و در ضریب رقت ضرب و نتیجه را به عنوان تخمین شمارش کلی گزارش کنید.
ج: اگر تعداد پرگنه ها در یک قسمت از 8 قسمت پلیت مربوط به بالاترین رقت از 200 بیشتر است (200 x 8 = 1600)، آن را در ضریب رقت ضرب کرده و عدد حاصل را به صورت بیشتر از (<) به عنوان تخمین شمارش کلی گزارش کنید. در تمام موارد توصیه می شود که رقت را در پرانتز ذکر نمایید.
د: موقعی که در پلیت های کشت شده از غلیظ ترین رقت پرگنه ای دیده نمی شود. شمارش تخمینی را کمتر از (>) نیم برابر رقت گزارش شود.
7. محاسبه و گزارش نتایج: فقط دو رقم معنی دار باید در گزارش شمارش استاندارد میکروبی و شمارش تخمینی میکروبی بیان شود که این دو رقم اولین و دومین رقم از سمت چپ میانگین شامرش ها بوده و سایر ارقام با صفر بیان می شود. به عنوان مثال اگر شمارش 523000 باشد، به صورت 52 x 104 گزارش می گردد. اگر سومین رقم از سمت چپ 5 یا بیشتر باشد، یک واحد به دو رقم اضافه می شود. به عنوان مثال اگر شمارش 83600 باشد، ان را به صورت 84000 یا 84 x 103 بیان کنید.
8. بازدارنده ها: وجود بازدارنده ها مخصوصا در مواردی که رقت های پایین تر به طور محسوسی کمتر از میزان مورد انتظار است، مورد شک قرار می گیرد. در این صورت آزمایش های مختلفی برای تشخیص وجود بازدارنده های احتمالی باید مورد توجه قرار گیرد.
9. گزارش و تفسیر نتایج:
الف: حسب مورد شمارش ها را به عنوان شمارش صفحه ای استاندارد (SPC) یا شمارش کلی تخمینی (ESPC) در یک ماده غذایی بیان کنید.
ب: هنگامی که آزمایش شمارش کلی برای تصمیم گیری در مورد قبول یا رد یک محموله غذایی مورد استفاده قرار گیرد، فقط باید از روش (SPC) استفاده شود و هرگز نباید از شمارش کلی تخمینی استفاده نمود.
از نظر سازمان های کنترل کننده ی روش (ESPC) فقط به عنوان نتیجه گیری تقریبی اولیه و برای ارزیابی کیفیت میکروبی ماده غذایی مفید است.
10. قابلیت تکرار و خطا فردی: شمارش مجدد یک پلیت اگر توسط آزمایشگر قبلی انجام شود، باید حداکثر 5 درصد شمارش اولیه و موقعی که توسط شخص دیگری انجام می شود، حدود 10 درصد شمارش اولیه اختلاف داشته باشد. اگر تغییرات بیش از این حدود باشد، ممکن است علل مختلفی مانند ضعف دید، اشکال در تشخیص پرگنه های ریز یا معمولا اشکال در تشخیص پرگنه ها و تفکیک آن ها از ذرات غذا سبب آن باشد.
منبع: کتاب آزمون میکروبی مواد غذایی، دکتر گیتی کریم، انتشارات دانشگاه تهران، چاپ دوم 1374
