دانشجویان مواد دانشگاه تجن

گرچه منزل بس خطرناک است و مقصد بس بعید، هیچ راهی نیست که آن را نیست پایان، غم مخور

دانشجویان مواد دانشگاه تجن

گرچه منزل بس خطرناک است و مقصد بس بعید، هیچ راهی نیست که آن را نیست پایان، غم مخور

روش های کشت باکتری

آزمایش: انواع کشت باکتری

هدف: تفهیم روش ها، مراحل کشت باکتری و بررسی رشد آن ها 

به نام خدای علم و اندیشه


مقدمه:

محیط کشت:

از آن جا که میکروب یک موجود تک سلولی بوده و قادر است کلیه اعمال حیاتی خود را مستقلا انجام دهد بدون آن که نیاز به سلول دیگری داشته باشد. این اصل بیانگر آن است که میکروب ها هم احتیاج به غذا و آب و مواد آلی و معدنی دارند. محیطی مغذی که حاوی کلیه احتیاجات یک میکروب اعم از مواد غذایی و عناصر و غیره باشد که موجب رشد آن میکروب شود را اصطلاحا محیط کشت می گویند.

این محیط کشت می تواند به صورت دست ساز بوده یا به طور طبیعی یعنی داخل سلول های بدن یک جانور باشد.

میکروب ها را می توان بر روی محیط ها و در ظروف مختلف کشت داد که انتخاب شکل بستگی به نوع کشت دارد. مثلا در کشت هایی که محیط آن مایع است ظروف کشت لوله ای می باشد و محیط های جامد (آگاردار) هم در پلیت و هم در لوله کشت داده می شوند.

انواع کشت باکتری:

1- کشت باکتری در محیط کشت مایع (Broth)

2- کشت باکتری در محیط کشت جامد (Agar)

روش کشت باکتری در محیط کشت مایع:

1- ابتدا یک آنس حلقوی برداشته و آن را در دست راست بگیرید. بعد آن را روی شعله کاملا سترون کنید و بگذارید تا سرد شود.

2- محیط حاوی باکتری (لوله یا پلیت) را در دست چپ بگیرید و درب آن را با دست راست در کنار شعله باز کنید. دقت کنید که درب محیط کشت را روی میز کار خود نگذارید.

3- اگر محیط کشت در لوله است دهانه آنرا چند با ر از روی شعله عبور دهید تا سترون شود همچنین درب لوله را بیش از حد باز نگه ندارید.

4- نوک آنس را وارد محیط کرده و یک لوپ از آنرا بردارید. منظور از لوپ سوزن کشت با نوک حلقه ای است .

5- دهانه لوله را مجددا با شعله سترون کرده و درب آن را بگذارید و محیط کشت را در جای خود قرار دهید.

6- لوله حاوی محیط کشت را در دست چپ بگیرید و نوک آنس آلوده به باکتری مورد نظر را داخل محیط فرو برده و به آرامی تکان دهید تا میکروب ها در محیط پخش شوند.

7- در مواردی که میکروب را از پلیت (محیط کشت جامد) بر می دارید با نوک آنس کمی از پرگنه را برداشته و با رعایت مواردی که گفته شد آن را داخل محیط مایع فرو برده و به آرامی هم بزنید تا همگن شود.

8- دهانه لوله حاوی محیط کشت جدید را با شعله سترون کرده و درب آن را بگذارید و آن را در داخل انکوباتور قرار دهید.

9- نوک آنس را مجددا با شعله استریل کرده و در جای خود قرار دهید.

روش کشت باکتری در محیط جامد:

محیط کشت جامد به دو صورت وجود دارد : 1- محیط کشت جامد در لوله 2- محیط کشت جامد در پلیت

در لوله به دوصورت عمودی ((Stab Culture و شیبدار (Slant Culture) دیده می شود که هر کدام از آن ها روش کشت خاص خود را دارند.

روش کشت عمقی در لوله:

در این حالت محیط کشت آگار دار (جامد) را با حفظ شرایط استریل در حالت مذاب داخل لوله های آزمایش استریل ریخته و به حالت عمودی آن را در یک جای ساکن قرار دهید تا سرد شود در این حالت با آنس نوک تیز استریل شده در کنار شعله از پرگنه باکتری مقداری را برداشته و آن را به صورت عمودی در مرکز این محیط تا انتها فرو برده و بدون هیچ گونه تغییر حالتی آن را از همان مسیر خارج کنید . بعد لوله را در انکوباتور قرار دهید . این روش کشت دارای خصوصیاتی می باشد و آن این است که هنگامی که نوک آنس را در محیط فرو می برید در ابتدای ورود آنس به محیط تراکم باکتری زیاد است و به ترتیب که به عمق محیط فرو می رود از تعداد باکتری ها کاسته می شود تا به انتهای لوله که می رسد تراکم باکتری به حداقل می رسد و از طرفی در انتهای محیط کشت لوله ای اکسیژن کمتر از قسمت سطحی آن است و باکتری ها به ترتیبی که با تراکم وارد محیط شده اند براساس نیاز با اکسیژن (هوازی یا بی هوازی بودن) در محیط رشد متفاوتی دارند. یعنی اگر باکتری هوازی باشد رشد آن در قسمت سطحی بیشتر است و اگر بی هوازی باشد رشد آن در قسمت عمقی بیشتر می شود.

روش کشت در سطح شیبدار در لوله:

در این حالت محیط کشت آگار دار استریل را در لوله های استریل شده ریخته و قبل از سرد شدن آن ها را به حالت شیبدار قرار می دهند تا سرد شوند. در این حالت با آنس سوزنی با حفظ شرایط استریل از پرگنه باکتری برداشته و در کنار شعله نوک آنس را ابتدا به صورت عمودی وارد قسمت عمودی محیط کشت کرده بعد به آرامی آن را از همان مسیر خارج کرده و بدون این که نوک آنس از محیط جدا شود آن را به حالت زیگزاگ روی سطح شیبدار بکشید.

این روش هم خصوصیات بسیار زیادی از جهت تشخیص سویه های باکتری دارد و اطلاعاتی در مورد هوازی یا بی هوازی بودن آن ها و هم چنین خصوصیات منحصر به فرد باکتری ها به ما می دهد. مثلا ممکن است در کشت یک نوع باکتری، رنگ قسمت عمودی محیط کشت تغییر کند که نشانگر بی هوازی یا بی هوازی اختیاری بودن باکتری است که بعدا در تست های اختصاصی دیگر را روی آن انجام می دهیم یا مثلا باکتری ها فقط در قسمت شیبدار رشد می کنند و رنگ آن قسمت تغییر می کند که پی به هوازی بودن آن می برید.

روش دیگر کشت روی این محیط از محیط مایع می باشد که یک لوپ از کشت مایع باکتریایی برداشته و در سطح شیبدار بصورت زیگراک می کشید و کشت می دهید.

روش کشت خطی:

در این روش از محیط پیش ریخته استفاده می شود. به این ترتیب که ابتدا به وسیله یک آنس حلقوی سترون شده مقداری از پرگنه باکتری را برداشته و آن را روی سطح محیط پیش ریخته به صورت خط های موازی و در چند جهت می کشید. در کشت های خطی برای بدست آوردن کلونی های تک می توانید پلیت را به 4 قسمت تقسیم کنید بعد در قسمت اول ابتدا نوک آنس را که محتوی پرگنه باکتری است را به صورت خط های موازی کشیده و بعد خطوط را در منطقه دوم از انتهای خط انتهایی منطقه اول در جهت دیگر ادامه می دهید و در منطقه سوم و چهارم هم به همین صورت عمل می کنید. خصوصیت این روش این است که وقتی خطوط موازی را روی سطح محیط می کشید به ترتیب از تراکم باکتریها کاسته می شود و به انتهای خط که می رسید تراکم باکتری کمتر است و در منطقه دیگر وقتی از انتهای خط منطقه قبلی استفاده می کنید در واقع تراکم بسیار کمتر از تراکم باکتریها در ابتدا می باشد و در نتیجه در مناطق دیگر هم به ترتیب از تعداد باکتری ها کاسته می شود تا جایی که در منطقه چهارم شما می توانید پرگنه های تکی داشته باشید که کلونی خالص نامیده می شود. بنابراین انجام درست کشت خطی منجر به ایجاد کلنی خالص می شود این کلونی تنها از یک باکتری مادری به وجود می آید (تعریف کلونی خالص). باکتری های منفرد را باکتری های مادر می نامند که این باکتری ها پس از کشت خطی و جدا شدن سلول های باکتری از یکدیگر به وجود می آیند.

توجه داشته باشید که کلونی خالص به کلونی گفته می شود که با کلونی دیگر تماس نداشته باشد.

در مورد محیط های کشت باکتریایی که به صورت مایع می باشند برای انجام کشت خطی روی محیط پیش ریخته فقط یک بار لوپ را داخل محیط محتوی باکتری کرده و یک لوپ از آن بردارید سپس آن را روی محیط پیش ریخته قرار داده و به صورت خطوط موازی آن را در چند جهت بکشید و یا مراحل فوق را روی آن انجام دهید.

از آن جا که مراحل کار انجام شده در آزمایشگاه، روش های اصولی و تعریف شده برای آزمایشات می باشد و این مراحل را نیز در آزمایشگاه طبق همان اصول انجام داده ایم، تکرار دوباره ی مباحث بیان شده در گزارش کار لزومی ندارد.

این گروه نیز کشت در محیط مایع، کشت در سطح شیبدار و کشت به روش خطی را در محیط پلیت کانت آگار انجام داده است.

<!--[if !supportLists]-->·     <!--[endif]-->در انجام آزمایشات بر روی محیط کشت جامد سعی شود تا زمان کار بر روی محیط کشت به محیط آسیبی نرسد.

<!--[if !supportLists]-->·     <!--[endif]-->دقت شود تا محیط کشت را به همراه کلونی از محیط کشت قبلی برداشت نکنیم.

<!--[if !supportLists]-->·     <!--[endif]-->شرایط لازم برای نمونه های آماده شده، مدت 48 ساعت و دمای 37 درجه سانتی گراد می باشد.

<!--[if !supportLists]-->·     <!--[endif]-->توجه داشته باشید که این آزمایش را نیز مانند تمام آزمایشات در شرایط استریل و در کنار شعله انجام می شود.

نتیجه:

محیط کشت مایع: در نتیجه این آزمایش می توان تعداد زیادی از انواع باکتری از قبیل هوازی، بی هوازی و آئروفیل را مشاهده کرد.

محیط کشت جامد:

کشت عمقی در سطح شیبدار: تعداد زیادی کلونی های رشد یافته را می توان دید که به رنگ کرم می باشند و هم چنین باکتری هایی به رنگ زرد پر رنگ نیز در سطح محیط وجود دارند.

کشت خطی: کلونی های رشد یافته را می توان مشاهده کرد و هم چنین در این نمونه یک کلونی خالص مشاهده می شود.

خطای آزمایش:

برداشت نادرست کلونی یا انجام روش نادرست کشت باکتری ها به وی‍ژه در روش خطی می تواند در نتیجه ی آزمایش اختلال ایجاد می کند.

منبع: www.azmayeshat.mihanblog.com        


شرایط لازم برای نمونه های آماده شده، مدت 48 ساعت و دمای 37 درجه سانتی گراد می باشد./p dir=
نظرات 0 + ارسال نظر
برای نمایش آواتار خود در این وبلاگ در سایت Gravatar.com ثبت نام کنید. (راهنما)
ایمیل شما بعد از ثبت نمایش داده نخواهد شد