رنگ آمیزی گرم

آزمایش: رنگ آمیزی گرم

هدف: آموزش روش رنگ آمیزی گرم و آشنایی با باکتری های گرم مثبت و منفی و تفکیک آن ها از یکدیگر

به نام خالق یکتای عالم

مقدمه:

رنگ‌آمیزی گرم یکی از مهم ‌ترین و متداولترین روش‌های رنگ آمیزی در میکروبیولوژی است که اولین بار توسط کریستین گرم ابداع شد. در این رنگ آمیزی باکتری‌ها بر مبنای رنگ باکتری پس از رنگ آمیزی به دو دسته گرم مثبت و گرم منفی تقسیم می ‌شوند. رنگ باکتری پس از رنگ آمیزی به توانایی حفظ رنگ اول و به عبارتی به ساختمان دیواره سلولی باکتری بستگی دارد. در رنگ آمیزی گرم باکتری‌های گرم مثبت پس از رنگ آمیزی به رنگ بنفش و باکتری‌های گرم منفی به رنگ قرمز مشاهده می‌شوند. گرچه هر دو گروه یعنی باکتری‌های گرم مثبت و منفی دارای دیواره می‌باشند ولی فرق بین این دو گروه مربوط به خواصی است که در ساختمان دیواره سلولی آن ها وجود دارد. اساس ساختمان در دیواره سلولی باکتری‌های گرم مثبت یک لایه ضخیمی‌ است از پپتیدوگلیکان، ولی در باکتری‌های گرم منفی ضخامت آن به حداقل می‌ رسد.

کاربرد رنگ آمیزی گرم:

از رنگ آمیزی گرم به دو جهت استفاده می ‌شود:

·شناسایی جنس باکتری

·انتخاب آنتی بیوتیک مناسب (باکتری‌های گرم مثبت در مقایسه با باکتری‌های گرم منفی نسبت به پنی سیلین حساسیت بیشتری دارند)

با این حال همه ی باکتری‌ها را نمی‌توان با رنگ آمیزی گرم مشاهده نمود.

گزارش کار:

در روش رنگ آمیزی گرم ابتدا باید گسترش یا اسمیر تهیه نمود و آن را تثبیت کرد که برای این عمل ابتدا یک لام برداشته و آن را با پنبه و الکل ابتدا تمیز کرده و سپس یک قطره آب مقطر یا سرم فیزیولوژی بر روی لام می ریزیم و پس از آن با استفاده از یک آنس استریل یک کلونی برداشته و بر روی آب مقطر موجود بر روی لام قرار داده و پخش می کنیم. حال لام و نمونه را بر روی شعله چهار الی پنج بار گذرانده تا آب و نمونه خشک شود و نمونه ی فیکس شده حاضر شود. سعی شود تا لام بیش از اندازه حرارت نبیند و داغ نشود زیرا موجب از بین رفتن نمونه می شود که برای جلوگیری از این خطا پس از چند بار گذراندن لام از روی شعله، لام را به پشت دست می زنیم و زمانی حرارت مناسب است که دست را نسوزاند.

در مرحله بعد از کریستال ویوله استفاده کرده و چند قطره از آن را بر روی نمونه می ریزیم و به مدت یک دقیقه صبر می کنیم و سپس نمونه را با آب مقطر شستشو می دهیم تا رنگ های اضافی شسته شود. سپس چند قطره از معرف رنگی لوگل را بر روی نمونه می ریزیم و به مدت یک دقیقه صبر می کنیم و حال با استفاده از الکل یا استون رنگ بری را انجام می دهیم. مدت زمان این مرحله 10 ثانیه می باشد.

به موجب تثبیت رنگ توسط کریستال ویوله و لوگل و از بین بردن این عمل، از الکل استفاده می شود. زیرا باکتری های گرم منفی در این مرحله رنگ دیواره ی خود را از دست داده و این رنگ بری زمانی است که الکل، لیپید موجود در دیواره را در خود حل کرده است و هم چنین باکتری های گرم مثبت به همان رنگ ثابت باقی می مانند و اگر بیش از 10 ثانیه شود باکتری های گرم مثبت نیز بدون رنگ می شوند و در آزمایش خطا پیش می آید.

در مرحله بعد با آب مقطر دوباره نمونه را شستشو داده و پس از شستشو از رنگ فوشین یا سافرانین استفاده   می شود و چند قطره از آن را بر روی نمونه ریخته ، به مدت 30 ثانیه که این معرف برای رنگ آمیزی   باکتری های گرم منفی می باشد که در مرحله ی قبلی رنگ خود را از دست داده اند و سپس دوباره نمونه را شستشو داده و حال نمونه را در مجاورت هوا قرار داده تا خشک شود و سپس یک لامل بر روی نمونه         می گذاریم و در زیر میکروسکوپ مشاهده می نماییم که باید در مشاهدات خود، باکتری گرم مثبت را به رنگ بنفش و باکتری گرم منفی را به رنگ قرمز مشاهده کنیم.

·     مراحل این آزمایش را بر روی تشتک رنگ آمیزی انجام دهید.

·     توجه داشته باشید که این آزمایش را نیز مانند تمام آزمایشات در شرایط استریل و در کنار شعله انجام می شود.

نتیجه:

در این آزمایش و رنگ آمیزی باکتری و مشاهده در زیر میکروسکوپ باکتری هایی به رنگ قرمز و بنفش که نمایان گر باکتری های گرم منفی و گرم مثبت است، مشاهده گردید.

خطای آزمایش:

برداشت نادرست کلونی و هم چنین رنگ آمیزی اشتباه و رعایت نکردن زمان های تعیین شده و خصوصا  استفاده ی نادرست الکل می تواند در نتیجه آزمایش تاثیر گذار باشند.

منبع:

www.wikipedia.org