هدف: محاسبه بیشترین تعداد احتمالی باکتری ها در یک نمونه ی آبی و به طور کلی بررسی آلودگی آب
به نام خدایی که آغاز همه چیز با او است
مقدمه:
آزمایش MPN (Most Probable Number) روش محاسبه بیشترین تعداد احتمالی باکتری در یک نمونه است، یعنی از طریق این آزمایش می توان تعداد باکتری ها را در سطحی کم محاسبه کرد. در این آزمایش بیشتر برای نمونه های مایع بکار می رود. از جمله مهم ترین کاربرد های آن ر بررسی میکروبی آب است، به طوری کلی آلودگی موجود در آب به شکل های مختلفی و از طریق محیط طبیعی، خاک، مواد دفعی روده ی انسانی یا حیوانی (مدفوعی و از جمله ی مهم ترین این باکتری ها می توان به کلی فرم ها اشاره کرد) وارد آب می شوند. آزمایشات کنترل کیفی برای نظارت بر یک محصول پس از اتمام روند تولید می باشد و در مبحث آب و فاضلاب به کلیه آزمون هایی که با آن بتوان کیفیت خواسته شده محصولات اعم از آب و فاضلاب را نظارت و کنترل نمود اطلاق می گردد. مبحث کنترل کیفیت در سیستم های تولید مبتنی بر مشتری مداری، دارای اهمیت قابل ملاحظه ای است و نظارت بر روند تولید و کنترل محصول نهایی یکی از ارکان اساسی مرکز مولد کالاست. در جوامع پیشرفته امروزی با توجه به اهمیت سلامت اعضای آن ها تمهیداتی اندیشیده می شود تا آب سالم و بهداشتی در اختیارشان قرار بگیرد و صرف تامین آب برای مشترکین مطرح نمی باشد. بدیهی است در این گونه جوامع اتفاقات منجر به آلودگی آب تا حد بسیار زیادی پیشگیری شده و در صورت واقع شدن با انجام آزمایشات مداوم و برنامه ریزی شده به سرعت شناسایی و رفع خواهد شد. شبکه های آب در حالت ایده آل شبکه ای ایزوله بدون هیچ گونه راه نفوذ آلودگی می باشد و آزمایشات کنترل کیفی انجام شده برای پایین آمدن ضریب احتمال آلودگی می باشد. در روند انجام آزمایشات قرار بر سلامت آب گذاشته می شود مگر آن که خلاف آن ثابت شود و در صورت مشاهده نتایج منتهی به آلودگی آب سریعاٌ نسبت شناسایی نوع و محل آلودگی اقدام و بایستی رفع آلودگی گردد. از آن جایی نمونه های مایع انتخاب می شود که توزیع یکنواختی از میکروارگانیزم ها را در مایع می توان مشاهده کرد. این آزمایش به دو صورت 3 لوله ای و 5 لوله ای برای بالا بردن سطح دقت آزمایش انجام می شود و هر دو دارای یک روند می باشند.
لازم به ذکر است کلیفرم ها جزو فلور طبیعی روده انسان بوده و مقاوم به املاح صفراوی و تبدیل کننده لاکتوز به اسید لاکتیک و تولید گاز co2 در لوله درهام را باعث می گردد. گروه کلیفرم ها باکتری های هوازی و بی هوازی اختیاری، گرم منفی، بدون اسپور و میله ای شکل هستند.
بر طبق انجام آزمایش بر روی محیط کشتی لاکتوز براث معرفی این محیط نیز به طور مختصر به شرح ذیل می باشد.
محیط کشت لاکتوز براث Lactose Broth:
این محیط به منظور استفاده برای تشخیص کلیفرم ها در آب و فاضلاب به کار برده می شود. این محیط از نظر شکل فیزیکی مایع بوده که در لوله های آزمایش تقسیم می شود . پودر حاضر توسط کارخانه سازنده تهیه شده و به بازار عرضه می شود. این محیط در دو غلظت ضعیف و قوی (13گرم درلیتر و 26 گرم در لیتر) تهیه و مورد استفاده قرار می گیرد. پس از تهیه محیط کشت در غلظت های یاد شده، آن را در لوله های آزمایش بزرگ دورهام دار به مقدار 10 میلی لیتر (قوی) و در لوله های متوسط به مقدار 10 میلی لیتر (ضعیف) تقسیم می نمایند و پس از مسدود نمودن درب لوله ها با پنبه و در پوش آلومینیومی، آن ها را در ظرف مناسب ( سبد سیمی( قرار داده و در اتوکلاو در درجه حرارت 121 درجه سانتیگراد به مدت 15 دقیقه آن ها را استریل نموده و پس از سرد شدن در یخچال نگهداری می شود. لوله هایی که به این منظور تهیه شده اند، باید طوری انتخاب شوند که پس از ریختن محیط کشت درون آن ها، به مقدار لازم بیش از نصف لوله را اشغال ننماید.
این آزمایش به دو روش غیر مستقیم و مستقیم انجام می شود و تفاوتشان در این است که قبل از قرار دادن حجمی از نمونه ها در محیط کشت، در روش غیر مستقیم ابتدا رقیق سازی نمونه انجام می شود و سپس از آن استفاده می شود.
برای بررسی مثبت بودن این آزمایش عومل زیر را در نتیجه ی آزمایش بررسی می کنیم:
تولید گاز (همان بخارات گازی ایجاد شده در لوله ی درهام)، کدورت (شاخص رشد که از کدر شدن محیط بررسی می شود)، تولید اسید و باز(با استفاده از شناساگر PH مانند کاغذ تورنسل) و هم چنین واکنش های احیایی (استفاده از ترکیباتی مانند متیلن بلو که با جذب الکترون تغییر رنگ را در لوله های آزمایش ایجاد می کند.
آزمون تاییدی:در این آزمون یکی از آن لوله هایی که واکنش مثبتند را برداشته و یک آنس حلقوی استریل را در نمونه موجود در لوله فرو برده و تکان می دهیم و حال در محیط کشت EMB (ائوزین متیلن بلو) به شکل زیگزاگ یا خطی کشت می دهیم و سپس به مدت 48 ساعت و در دمای 35-37 درجه سانتی گراد در انکوباتور قرار می دهیم. پس از گذشت این زمان نتایج حاصله از آزمایش طبق معیار ذیل گزارش می شود.
کلونی هایی به رنگ تیره (سیاه، سبز تیره) با جلای فلزی نشان گر وجود باکتری E.Coli و در نتیجه تاکید کننده وجود کلی فرم هاست.
کلونی های به رنگ قرمز و یا صورتی نشان گر وجود باکتری انتروباکتر است.
آزمون تاکیدی:
به دنبال آزمون تاییدی آزمون دیگری انجام می شود که این آزمون به علت بررسی رشد میکروارگانیزم های دیگر انجام می شود و طبق روش زیر انجام می شود:
یک محیط کشت LB (لاکتوز براث) برداشته و یک کلونی را از نمونه ی موجود در آزمون تاییدی برداشته و در محیط کشت قرار می دهیم و طبق روش MPN، نتایج حاصله و مثبت بودنشان، نشان گر وجود میکرو ارگانیزم های دیگر است.
آزمون تکمیلی:
این آزمون در مبحث میکروبیولوژی مواد غذایی گنجانده شده است و بر طبق روش زیر می باشد:
برای انجام این آزمایش از تمام لوله های مثبت در آزمایش تاییدی ، نمونه ها را بر روی یک یا چند بشقاب حاوی محیط کشت ENDO یا EMB (ائوزین متیلن بلوآگار) کشت می دهند. سپس محیط کشت داده شده را به مدت 24 ساعت در انکوباتور 35 درجه سانتی گراد قرار می دهند. پس از این مدت کلونی های بدست آمده را مورد مطالعه قرار می دهند .
کلونی هایی که روی محیط کشت ENDO یا EMB رشد کرده اند ، به سه دسته مشخص ، نامشخص و منفی تقسیم میشوند . کلنی های مشخص دارای مرکز سیاه با جلای فلزی میباشند . کلنی های نامشخص به کلنی هایی گفته میشود که بدونه مرگز سیاه ، موکوژی شکل ، غیر شفاف و صورتی رنگ هستند و کلنی های منفی به سایر کلنی های با مشخصات دیگر گفته می شود .سپس از هر بشقاب کشت داده شده ، یک یا چند کلنی مشخص انتخاب نموده و در یک لوله محتوی آبگوشت لاکتوز دار و یک لوله محیط آگار شیب دار کشت میدهند.سپس به مدت 24 یا 48 ساعت در حرارت 35 درجه سانتی گراد قرار می دهند . پیدایش گاز در لوله آگوشت لاکتوز دار ، به منزله مثبت بودن نتیجه آزمایش از نظر کلی فرمهاست . برای تائیید نهایی ، از کلنی های رشد کرده بر روی لوله حاوی آگار شیبدار ، اسلاید تهییه نموده و به روش گرم رنگ آمیزی می نمایند . دیدن باسیل های گرم منفی بدون اسپور دلیل بر وجود کلی فرمها و مثبت بودن نتیجه آزمایش است .
منبع:www. treatmentprocesses.blogfa.com
