ویژگی های میکروبی نوشابه های گازدار طبق جدول زیر می باشد:
|
ویژگی ها |
حداکثر مجاز در هر میلی لیتر |
|
شمارش کلی باکتری های هوازی مزوفیل |
10 |
|
میکروارگانیزم های مقاوم به اسید |
منفی |
|
کپک ها |
منفی |
|
مخمر ها |
منفی |
بر اساس استاندارد 3845 سازمان ملی استاندارد ایران
رطوبت نسبی محیط: برای نگهداری مواد غذایی باید به مواد غذایی و میکروارگانیزم های برخورد کننده با آن ها توجه کرد و نمی توان هر شرایطی را برای ماده غذایی تعیین نمود، زیرا میکروارگانیزم ها در شرایط مختلفی زیست می کنند و در شرایط مطلوب خود به بافت های ماده ی غذایی حمله می کنند.
وقتی ماده غذایی که aw پایین دارد در اتمسفری با رطوبت نسبی بالا واقع شود، شروع به جذب رطوبت از محیط خواهد نمود و این عمل تا رسیدن به تعادل ادامه خواهد یافت. همین طور نیز غذایی که aw بالایی دارد وقتی در محیطی واقع شود که رطوبت نسبی پایینی دارد، آب از دست خواهد داد.
رطوبت نسبی و درجه حرارت محیط با یکدیگر ارتباط نزدیکی دارند، به طور کلی دمای بالاتر موجب رطوبت نسبی پایین تر می شود و بلعکس دمای پایین با رطوبت نسبی بالا همراه است. باید دقت نمود که غذاهایی که بیشتر دچار فساد سطحی می شوند، باید در انبار هایی قرار گیرند که دارای رطوبت نسبی کمی است.
چنین به نظر می آید که با کاهش رطوبت نسبی اتمسفر انبار، می توانیم تغییرات نامطلوب ناشی از فساد سطحی را در برخی مواد غذایی به حداقل برسانیم. ولی باید به خاطر داشت که در چنین محیطی که رطوبت نسبی پایین است، ماده غذایی، خوب آب از دست می دهد و در نتیجه تغییرات نامطلوب دیگری در آن پدید می آید. بنابراین در انتخاب رطوبت نسبی محیط همواره باید دو پارامتر را با هم، در نظر گرفت:
1. فساد سطحی در کدام رطوبت نسبی به وجود می آید؟!
2. محصول در چه رطوبت نسبی نگهداری می شود تا حداقل تغییرات کیفی درآن پدید آید؟!
حضور و غلظت گازها: به طور کلی انبار هایی که میزان CO2 در فضای آن ها بیش از 10 درصد است به نام انبار هایی با اتمسفر کنترل شده (Controlled atmosphere) معروف هستند. این انبار ها در برخی نقاط برای نگهداری سیب و گلابی استفاده می شود. معمولا اثر بازدارندگی CO2 با کاهش دما افزایش می یابد، این امر به طور عمده مربوط به افزایش حلالیت این گاز در درجه حرارت های پایین است. حساسیت باکتری های G- نسبت به CO2 بیشتر از انواع G+ است سودوموناس از جمله حساس ترین باکتری ها نسبت به CO2 است و بلعکس اسید لاکتیک باکتری ها و باکتری های بی هوازی مقاوم ترین انواع، در برابر این گاز هستند.
در رابطه با مکانیزم تاثیر CO2 بر رشد میکروارگانیزم ها و اثر بازدارنده ی این گاز دو نظریه وجود دارد. نظریه اول چنین است که CO2 باعث بلوکه شدن (متوقف شدن) متابولیسم شده و بر مجموعه ی واکنش های دکربوکسیلاسیون (حذف گروه کربوکسیلی) آنزیماتیک اثر می گذارد و نظریه دوم بر این اساس است که CO2 بر نفوذ پذیری غشای سلول اثر می گذارد.
در بحث برخورد میکروارگانیزم ها با گاز CO2 جا دارد که از اتوتروف ها که با استفاده از CO2 هوا به عنوان منبع کربن همه ی مواد آلی مورد نیاز خود را به تنهایی می‌سازند و هم چنین هتروتروف ها که کربن موجود در CO2 به طور مستقیم به مصرف آن ها نمی رسد، نام برد.
گاز اوزن نیز دارای اثر بازدارندگی بر روی میکروارگانیزم هاست با این حال از آن جا که اکسیدان قوی است نمی توان برای نگهداری مواد اسید های چرب استفاده کرد، چرا که موجب کند شدن (Rancid) چربی می شود.
اتمسفر اصلاح شده (Modified atmosphere) در نگهداری مواد غذایی استفاده می شود که به بسته بندی مواد غذایی اضافه می شود. گوشت هایی که در اتمسفر اصلاح شده باشند، عمر نگهداری بیشتری در مقایسه با حضور در اتمسفر کنترل شده دارند زیرا غلظت CO2 بیشتر و دما کمتر است و موجب حل شدن CO2 در گوشت می شود و تبدیل به اسید کربنیک شده و اسید کربنیک موجب عدم رشد باکتری ها می شود.
حضور و فعالیت میکروارگانیزم های دیگر: برخی از میکروارگانیزم ها در مواد غذایی موادی تولید می کنند که ممکن است اثر بازدارنده ی رشد یا کشندگی داشته باشند، از جمله این ترکیبات می توان از آنتی بیوتیک ها، باکتریوسین ها، هیدروژن پراکسید (H2O2)، اسید های آلی، دی استیل و ... نام برد.
اینتر فرنس (Interfrence): «حالت عمومی تداخل میکروارگانیزم ها» پدیده ای است که با فعالیت گروهی از میکروارگانیزم های موجود سبب تخریب یا مهار فعالیت میکروارگانیزم دیگر می شود، این پدیده حالت عام و غیر اختصاصی داشته و در واقع دارای فعالیت آنتاگونیسم عمومی است.
آنتاگونیسم (ضد) لاکتیکی: «حالت اختصاصی اینترفرنس» این پدیده توسط باکتری های اسید لاکتیکی اعمال شده و سبب مهار یا کشندگی میکروارگانیزم های عامل فساد و عفونت های غذایی می شود. یکی از ترکیباتی که خاصیت ضد باکتریایی دارد، رتوری است که توسط لاکتوباسیلوس تولید می شود که در مقابل تعداد زیادی از میکروارگانیزم ها دارای فعالیت ضد میکروبی است.
کشت محافظت کننده (Protective Culture): میکروارگانیزم هایی را که به دلیل خواص مهار کنندگی شان می توان به مواد غذایی افزود، کشت محافظت کننده می گویند. از جمله خواصی که این محیط کشت ها باید داشته باشند این است که از نظر سلامتی مضر نباشند و ایجاد اثرات مفیدی در محصول نمایند و هم چنین اثرات نامطلوب بر روی خواص حسی نداشته باشند.
فناوری ترکیبی (Hurdle technology): روش های مهار شبکه ای
ترکیب پارامتر های داخلی و خارجی: سال ها قبل اثر منفرد پارامتر های داخلی و خارجی بر روی میکروارگانیزم ها مورد مطالعه قرار گرفت، اما از اواسط دهه ی 80 به بعد پیشنهاد شده است که از روشی استفاده گردد که در آن از چندین عامل موثر یا چند تکنیک موثر برای حفظ و نگهداری یک ماده غذایی در برابر عوامل میکروبی استفاده شود که به روش های مهار شبکه ای معروف است. مثلا در مورد جلوگیری از رویش اسپور های کلستریدیوم بوتولینوم از عواملی چون PH کم تر از 4/6، aw کم تر از 0/94، NaCl 10 درصد، NaNO2 با 120 ppm در دمای انکوباسیون کم تر از 10 درجه سانتی گراد و فلور میکروبی به شدت هوازی استفاده می ش
فساد مواد غذایی:
آلودگی و فساد گروه های مختلف مواد غذایی:
فساد در تعریف یعنی از دست دادن کیفیت مطلوب. هر ماده صدمه دیده که برای استفاده ی انسان نامطلوب باشد، فاسد تلقی می شود. فساد به سه دسته ی فیزیکی، شیمیایی و میکروبی تقسیم می شود.
فساد میکروبی مواد غذایی ناشی از فعالیت عمده ی میکروارگانیزم ها جهت تخریب مواد غذایی نیست بلکه آن ها نیز مانند همه ی موجودات زنده هدفی جز کسب انرژی و مواد مغذی جهت ادامه ی حیات خود ندارند.
به ماده ی غذایی ای فاسد تلقی می شود که تعداد میکروارگانیزم ها به حدی برسد که حس چشایی یا بویایی انسان تغییرات کیفی ناشی از فعالیت آن را تشخیص دهد، تا زمانی که به آن حد نرسد یا به عبارتی تا زمان فاسد شدن ماده غذایی را زمان ماندگاری (Shelf life) می گویند.
فساد میوه ها و سبزیجات:
عوامل اولیه ی فساد در این محصولات عبارتند از باکتری ها، کپک ها و مخمر ها و هم چنین موجودات دیگری هم چون کرم ها، انگل ها، ویروس ها، حشرات و ... نیز می توانند موجب فساد میوه ها و سبزی ها شوند.
متوسط ترکیبات موجود در سبزی ها عبارتست از 88 % آب، 8/6 % کربوهیدرات، 1/9 % پروتئین، 0/3 % چربی، 0/84 % خاکستر (املاح (Ash)) و مقداری ویتامین و اسید های نوکلئیک. درصد بالای آب در سبزی ها، رشد و فساد باکتریایی آن ها را تشدید می کند. دامنه ی PH اکثر سبزیجات در محدوده ی رشد باکتری ها است، بنابراین باکتری ها عامل اصلی فساد سبزیجات هستند. Eh نسبتا بالای سبزیجات، سبب می شود که انواع هوازی و بی هوازی اختیاری مهم تر از انواع بی هوازی جلوه کنند.
آب در میوه ها کم تر از سبزیجات است، در صورتی که میزان کربوهیدرات میوه ها بیشتر از سبزیجات است. مواد مغذی موجود در سبزی ها جهت رشد باکتری ها، مخمر ها و کپک ها کافی به نظر می رسد اما PH میوه ها به طور کلی پایین تر از محدوده ی PH مطلوب برای رشد باکتری ها می باشد. کپک ها و مخمر ها در محدوده ی وسیعی از PH رشد می کنند لذا آن ها به عنوان اولین عوامل فساد در میوه ها مطرح هستند و باکتری ها معمولا نقش کم تری در شروع فساد دارند.
مخمر ها اغلب سبب فساد میوه ها در مزارع می شوند. بسیاری از مخمر ها قادر به تخریب مواد غذایی در نتیجه ی تخمیر مواد قندی موجود در میوه ها می باشند و طی این فرایند ترکیباتی مانند الکل و CO2 تولید می کنند. تنفس و متابولیسم سلولی در این محصولات پس از برداشت ادامه دارد و باعث تشدید فساد میکروبی می شوند لذا برای افزایش زمان ماندگاری آن ابتدا باید عمل سورتینگ (Sorting) جهت جدا سازی میوه های سالم از انواع آلوده و ضرب دیده انجام شود و سپس عمل شستشو انجام گیرد. در شستشو علاوه بر زدودن گرد و خاک و گل بار میکروبی به حداقل می رسد. همچنین پس از شستشوی این محصولات باید در درجات حرارت پایین نگهداری شوند، زیرا در اثر تنفس پس از برداشت گرما تولید شده و درجه حرارت را افزایش می دهد و مناسب برای رشد دسته ای از میکروارگانیزم ها و هم چنین فساد شیمیایی می شود.
معرفی چند نوع فساد در میوه ها و سبزیجات:
فساد نرم (Sot rot): از جمله ی انواع فساد در میوه ها و سبزیجات می باشد. طی این فساد پکتین یا سلولز موجود در ساختمان میوه ها و سبزیجات توسط آنزیم پکتیناز (پکتین استراز یا پلی گالاکتوروناز) شکسته شده و به اسید گالاکتورونیک تبدیل می شود و در نهایت به ترکیبات دیگری تبدیل می شود که در نتیجه ی آن گیاه نرم می شود و ایستایی خود را از دست می دهد و بوی بد و ظاهری مرطوب به خود می گیرد. مثلا موز در اثر فساد نرم بافتش له می شود.
بوی بد حاصله احتمالا ناشی از ترکیبات فراری نظیر NH3 و اسید های فرار می باشد که بوسیله ی فلور (مجموعه) میکروبی تولید می شود و میکروارگانیزم ها در حین رشد در محیط اسیدی تمایل به دکربوکسیلاسیون کردن پروتئین ها یا اسید های آمینه دارند که در نتیجه ی این فعالیت آمین های ایجاد شده سبب افزایش PH به محدوده ی خنثی و حتی قلیایی می شود. گونه های مختلف Erwinia در فساد نرم سبزی ها اهمیت بیشتری دارند اما در میوه ها، کپک ها نقش بیشتر در فساد نرم دارند.
جنس اروینیاErwinia :
باکتری های این جنس معمولا عامل بیمار در گیاهان بوده و تولید آنزیم پروتوپکتیناز می کند. این باکتری ها گاهی در مواد غذایی یافت می شوند و گاهی نیز صفت احیا نیترات ها در آن ها دیده می شود. (نیترات را به نیتریت تبدیل می کنند) این باکتری عامل نرم شدن و فساد گیاهان می باشد چون پکتین گیاهان را تجزیه می کند.
میکروارگانیزم های اصلی مولد فساد نرم در بعضی میوه ها و سبزی ها به شرح زیر است:
|
میوه یا سبزی |
میکروارگانیزم |
|
سیب |
باسیلوس پلی مگزا Bacillus polymexa |
|
گلابی |
پنیسیلیوم اکسپنسوم (فساد قهوه ای)Penicilium expansum |
|
انگور |
رایزوپوس نیگریکانس (لکه های سیاه) Rizopus nigricans |
|
توت فرنگی |
رایزوپوس استولونیفر Rizopus stolonifer |
|
هویج |
اروینیا کارتوورا Erwinia cartovora |
|
کلم برگ |
بوتریتیس سینری Botrytis cinerea |
|
کرفس |
موکور رسموزاس (فساد صورتی) Mocur rosemosas |
|
گوجه فرنگی |
بایسوکلامایس فولوا Byssochlamis fulva |
فساد ترش (Soar rot): در این نوع فساد در اثر فعل و انفعالات میکروارگانیزم ها اسید تولید می شود و باعث ایجاد مزه ی ترشی نامطلوبی در میوه یا سبزی می شود. عامل اصلی این نوع فساد ژئوتریکم کندیدوم (Geotrichum candidum) است، البته گونه های دیگری از کپک ها و باکتری ها نیز موجب این نوع فساد می شوند.
گونه های مختلفی از کپک و مخمر و باکتری چنان چه امکان رشد بر سطح میوه و سبزی داشته باشند، می توانند باعث لزج شدن سطح میوه و سبزی شوند. در این فساد بیش تر باکتری ها به خصوص از جنس لوی کونوستوک (Leuconostoc) دخالت دارند.
فساد خاکستری (Graymold rot): فساد دیگری است که عامل آن Botrytis cinerea است که یک میسیلیوم خاکستری تولد می کند. این نوع فساد تحت شرایط رطوبت و دمای بالا به خوبی بروز می کند. این کپک قادر است از طریق پوست سالم، بریدگی به میوه ها و سبزیجات راه یابد. آنتراکنوز (Anthracnose) بیماری گیاهی است که با نقطه نقطه شدن برگ ها، میوه ها یا غلاف های دانه ها مشخص می شود. عامل مولد این بیماری کلتریکم کوکودس (Colletrichum coccodes) می باشد. این قارچ ها بیماری ضعیفی در گیاهان ایجاد می کنند. آن ها در بقایای گیاهی موجود در خاک و دانه ی گیاهان مختلف نظیر گوجه فرنگی از فصلی تا فصل دیگر زندگی می کنند. قارچ های مذکور در آب و هوای گرم و مرطوب به خوبی گسترش می یابند.
پتانسیل اکسیداسیون و احیا (Eh): میکروارگانیزم های مختلف نسبت به پتانسیل اکسیداسیون و احیای محیط های کشت مختلف حساسیت های متفاوتی دارند. این فاکتور به صورت زیر تعریف می شود:
توانایی یک ماده در کسب یا از دادن الکترون
به طور کلی وقتی وقتی یک عنصر یا ترکیب شیمیایی الکترون از دست می دهد، اصطلاحا گفته می شود که اکسید شده و بلعکس عنصر یا ترکیباتی که الکترون دریافت کنند، احیا می شوند.
تعریف دیگر اکسیداسیون و احیا: ترکیب سوبسترا با اکسیژن
Cu + <====> Cu2+ + e
Cu + + O2 <====> 2Cu2+O
سوبسترا (Cu): هر ماده ای که در واکنش شرکت می کند.
بنابراین ماده ای که به آسانی الکترون از دست می دهد، یک احیا کننده ی خوب محسوب شده و ماده ای که به راحتی الکترون می گیرد، یک اکسید کننده ی خوب خوانده می شود. زمانی که الکترون از یک جسم به جسم دیگر منتقل می شود، بین آن دو ماده اختلاف پتانسیل ایجاد می شود که مقدار آن بر حسب میلی ولت (mv) قابل اندازه گیری است.
به طور کلی هر چه ترکیبات شیمیایی بیشتر اکسید شوند به همان نسبت پتانسیل الکتریکی بالاتری خواهد داشت و برعکس احیا شدن یک ماده سبب می گردد که پتانسیل الکتریکی آن به همان نسبت کاهش یابد. ایجاد پتانسیل های مثبت و منفی در مواد غذایی نتیجه ی وجود ترکیبات شیمیایی خاص در آن فراورده ها است. برای مثال وجود گروه های SH (سولفیدرین که از میتورین، سیتئین، سوفوریل تشکیل شده است) در گوشت و اسید آسکوربیک و قند های احیا کننده در میوه ها و سبزی ها موجب ایجاد شرایط احیا در این محصولات می شوند.
Eh فراورده های گیاهی به ویژه عصاره ی میوه ها و سبزی ها بین +300 تا +400 میلی ولت می باشد. بنابراین جای تعجب نیست که عامل اصلی فساد این گونه مواد غذایی قارچ ها و باکتری های هوازی هستند. قطعات بزرگ گوشت دارای Eh 200- میلی ولت هستند. ولی Eh گوشت چرخ کرده بین +200 تا -200میلی ولت متغیر است (در گوشت چرخ کرده به دلیل ورود هوا و بار مثبتش، در هنگام چرخ کردن Eh می تواند به این گونه متغیر بوده و محدوده ی مثبت را در برگیرد). پنیر های مختلف دارای Eh منفی بوده، مقدار Eh از -20 تا -200 میلی ولت در نوسان است.
میکروارگانیزم ها احتیاجات Eh متفاوتی دارند. میکروب های هوازی برای رشد خود، احتیاج به Eh مثبت و میکروب های بی هوازی نیاز به Eh منفی دارند. مثلا باکتری های جنس کلستریدیوم که بی هوازی هستند، وجود Eh منفی برای رشدشان ضروری است و بلعکس باکتری های جنس باسیلوس جزء گروهی هستند که احتیاج به Eh مثبت دارند. پتانسیل اکسیداسیون و احیا بسته به نوع ماده غذایی و وضعیت شیمیایی متغیر است.
بر نوع مثبت و منفی بودن Eh، نیاز اکسیژنی دخیل است به گونه ای که باسیلوس ها شدیدا هوازی (aerobe) هستند و هم چنین کلستریدیوم ها کاملا بی هوازی اند (anaerobe) و این دو دسته هر دو ترموفیل هستند.
بعضی از باکتری های هوازی عملا در شرایطی که کمی احیا شده باشد، بهتر رشد می کنند. اغلب این میکروارگانیزم ها از نوع میکروآئروفیل (micro aerophil) هستند، از این دسته لاکتوباسیلوس ها و استرپتوکوکسی ها را می توان نام برد. دسته ی دیگر میکروارگانیزم ها در شرایط هوازی و بی هوازی قادر به رشدند که به این دسته بی هوازی اختیاری (facultative anaerobe) گفته می شود.
اکثر مخمر ها و کپک ها که درون غذا یا بر سطح آن ها رشد می کنند، از انواع هوازی هستند هر چند که برخی از آن ها به شرایط بی هوازی اختیاری نیز تمایل دارند.
ترکیبات مغذی: رشد و زندگانی میکروارگانیزم ها به آن وابسته است.
منابع ترکیبات مغذی:
· منبع انرژی: منشا آن کربن است که جهت انجام واکنش ها و فعالیت ها در میکروارگانیزم ها مصرف می شود. کربن برای یک میکروارگانیزم از طریق تجزیه ی قندها، اسید های آمینه، پلی ساکاریدها، الکل ها، چربی ها بدست می آید.
میکروارگانیزم ها تمایل به سهولت زندگی دارند و در یک محلول برای بدست آوردن کربن در صورت وجود چند منبع کربنی ابتدا به سمت منبع ساده تر یعنی قند ها می روند و سپس به سراغ پلی ساکارید ها که با تجزیه آن ها به قند ها منبع کربنی خود را بدست می آورند و چربی ها با سوزاندن آن ها جهت تامین کربن، می روند.
همانطور که یک انسان در صورت نبود منبع انرژی مناسب در صورت تغذیه نادرست از غذای نامناسب آسیب می بیند (بیماری نقرس بر اثر کمبود های غذایی بوجود می آید)، یک میکروارگانیزم نیز در چنین شرایطی آسیب می بیند.
قارچ ها و کپک ها توقع کم تری نسبت به باکتری ها داشته و با کم ترین نیاز ها زندگی می کنند. در بین باکتری ها نیز باکتری های G+ حساس ترند به طوری که آن ها را باکتری های عیانی یا پرتوقع (Fastiduce) می نامند هم چنین G-ها حساسیت و تمایل کم تری دارند .
· ازت: برای تامین نیتروژن که ساختار میکروارگانیزم ها را تشکیل می دهد، میکروارگانیزم ها به سوی اسید های آمینه می روند که به اسید های آمینه، پپتید ها و پپتید ها پروتیین ها را می سازند که با توجه به این مورد پلی آمینو اسید ها یا پروتیین ها، ترکیبات پپتیدی، نوکلئوتید ها در صورت نبود، آمینو اسید منابع دیگر تامین کننده ی اسید مورد نیاز میکروارگانیزم هستند.
· املاح: به طور معمول در مواد غذایی وجود دارند و به مصرف میکروارگانیزم ها می رسند.
· ویتامین ها: بخصوص ویتامین گروه B که باید در مواد غذایی مصرفی میکروارگانیزم ها وجود داشته باشد به استثناء قارچ ها و باکتری های G- که توان سنتز ویتامین B را دارند. اما G+ ها باید حتما مواد اندکی ویتامین B را در اختیار داشته باشند تا زیست کنند.
میوه ها ویتامین B کمتری نسبت به گوشت ها و هم چنین با وجود PH پایین و Eh مثبت، قارچ ها و کپک ها عامل فساد آن ها می باشند.
· ترکیبات ضد میکروبی: در بررسی های انجام شده بر روی ترکیبات آروماتیک، گیاهان، برخی خواص میوه ها، ادویه ها به ترکیباتی ضد میکروبی پی برده شد.
برخی گونه های گیاهان دارای روغن های اساسی (Esetial oil) هستند که نقش ضد میکروبی دارند. از جمله اوژنول (Eugenol) در میخک، آلیسین (Allicin) در سیر، سینامیک آلدهید (Cinamic aldehyde) و اوژنول در دارچین و آلیل ایزوتیوسیانات (Allyl isothiocyanat) در خردل و هم چنین در میوه ها، سبزی ها، چای، ملاس و دیگر منابع گیاهی ترکیباتی چون کافئیک اسید (Coffeic acid)، کلروژنیک اسید (Cholerogenic acid)، فرونیک اسید (Feronic acid) و پی کوماریک (P-qumaric) وجود دارند که دارای خواص ضد باکتری و ضد قارچی اند. اسید های آلی موجود در میوه ها و سبزی ها مثل اسید مالیک (اسید سیر، سبزی) اسید تارتاریک (انگور، ریواس) و اسید سوبکینیک (ریواس، چغندر) نیز از دسته ی ترکیبات ضد میکروبی اند. ترکیبات اوژنول و تیمول در مریم گلی و ایزوتیمول (کاواکرول) و تیمول در پونه کوهی را نیز می توان نام برد.
شیر گاو دارای چندین ترکیب ضد میکروبی است نظیر لاکتوفرین (Lactoferin)، سیستم لاکتوپراکسیداز و ترکیبی به نام لاکتینین.
تخم مرغ نیز دارای لیزوزیم (روی پوست) است که همراه با کنالبومین در تخم مرغ موجب حفاظت از میکروارگانیزم ها می شوند.
در واکوئل گیاهانی مثل کلم، گل کلم و شلغم ترکیبی به نام گلوکز زنیلات موجود است که در اثر صدمات و تخریب مکانیکی تولید ایزوتیوسیانات می کند که این ترکیب دارای خواص ضد باکتری و ضد قارچی است.
ساختمان بیولوژیک: پوشش طبیعی برخی مواد خوراکی که محافظی خوب در برابر میکروارگانیزم ها است و از ورود آن ها به بافت های داخل جلوگیری می کند. در این مورد می توان از ساختمان پوششس داخل دانه ها و پوشش سطحی میوه ها و پوسته ی سخت محصولات روغنی مثل پسته و بادام و...، پوسته ی خارجی تخم مرغ یا غشای نازک در بردارنده ی گوشت نام برد.
عوامل خارجی:
شامل خصوصیات محیط نگهداری و انبار داری مواد غذایی می شود که این خصوصیات هم ماده ی غذایی را تحت تاثیر قرار می دهد و هم بر روی میکروارگانیزم های موجود در مواد خوراکی تاثیر می گذارد که مهم ترین این فاکتور ها عبارتند از درجه حرارت انبار، رطوبت نسبی محیط، حضور گاز های مختلف و غلظت آن ها در اتمسفر انبار و حضور سایر میکروارگانیزم ها.
درجه حرارت انبار: دامنه ی حرارتی مناسب برای میکروارگانیزم ها بسیارگسترده است. پایین ترین درجه ای که برای فعالیت میکروارگانیزم ها مشاهده شده است دمای -34 درجه ی سانتی گراد می باشد. در حالی که بالاترین دما برای فعالیتشان قدری بیش از 90 درجه ی سانتی گراد است.
میکروارگانیزم ها از نظر نیاز حرارتی به سه دسته ی کلی سرما دوست، معتدل دوست و گرما دوست طبقه بندی می شوند.
· سرما دوست ها به دو دسته ی سایکروفیل (Psychrophil) که دمای بهینه ی آن 10-15 درجه ی سانتی گراد است و هم چنین سایکروتروف (Psychrotroph) (تروف به معنی تحمل کننده است) با دمای بهینه 20-30 درجه سانتی گراد تقسیم بندی می شوند.
· معتدل دوست ها یا مزوفیل (Mesophil) که دمای بهینه ی آن ها برای تکثیر و زیست 30-40 درجه سانتی گراد است و باکتری های بیماری زا عموما در این دسته قرار می گیرند.
· گرما دوست ها که در دو دسته ی ترموفیل (Thermophil) با دمای بهینه ی بیش از 45 درجه سانتی گراد یا بالاتر و ترمودیوریک (Thermoduric) که دمای بالا را تحمل می کند و رشدی ندارند؛ تقسیم می شوند. مهم ترین باکتری های دسته ترموفیل، باسیلوس ها و کلستریدیوم ها (غذاهای کنسروی) هستند.
میکروارگانیزم های سایکروفیل و سایکروتروف در درجه حرارت یخچال به خوبی رشد و نمو می کنند و باعث فساد مواد غذایی خوراکی مثل گوشت ها، ماهی ها، فراورده های گوشتی طیور، تخم مرغ و ... می شوند. قارچ هایی نظیر آسپرژیلوس نیز در دمای یخچال فعال می مانند. مخمر ها بیشتر به شرایط سایکروفیل ها و مزوفیل ها تمایل دارند و کم تر در دامنه ی ترموفیل فعالیت می کنند.
کیفیت مواد خوراکی نیز باید در انتخاب درجه حرارت مناسب برای نگهداری آن ها مورد توجه قرار بگیرد. شاید نگهداری کلیه ی مواد خوراکی در دمای یخچال یا کم تر از آن، امر مطلوبی به نظر آید ولی گاهی چنین نیست مثلا موز در درجه حرارت 13 تا 17 درجه سانتی گراد بهتر از دمای 5 تا 7 درجه سانتی گراد قابل نگهداری است. هم چنین برای بسیاری از سبزیجات مانند سیب زمینی، کرفس و کلم سفید درجه حرارت مناسب 10 درجه سانتی گراد می باشد.
پتانسیل اکسیداسیون و احیا (Eh): میکروارگانیزم های مختلف نسبت به پتانسیل اکسیداسیون و احیای محیط های کشت مختلف حساسیت های متفاوتی دارند. این فاکتور به صورت زیر تعریف می شود:
توانایی یک ماده در کسب یا از دادن الکترون
به طور کلی وقتی وقتی یک عنصر یا ترکیب شیمیایی الکترون از دست می دهد، اصطلاحا گفته می شود که اکسید شده و بلعکس عنصر یا ترکیباتی که الکترون دریافت کنند، احیا می شوند.
تعریف دیگر اکسیداسیون و احیا: ترکیب سوبسترا با اکسیژن
Cu + <====> Cu2+ + e
Cu + + O2 <====> 2Cu2+O
سوبسترا (Cu): هر ماده ای که در واکنش شرکت می کند.
بنابراین ماده ای که به آسانی الکترون از دست می دهد، یک احیا کننده ی خوب محسوب شده و ماده ای که به راحتی الکترون می گیرد، یک اکسید کننده ی خوب خوانده می شود. زمانی که الکترون از یک جسم به جسم دیگر منتقل می شود، بین آن دو ماده اختلاف پتانسیل ایجاد می شود که مقدار آن بر حسب میلی ولت (mv) قابل اندازه گیری است.
به طور کلی هر چه ترکیبات شیمیایی بیشتر اکسید شوند به همان نسبت پتانسیل الکتریکی بالاتری خواهد داشت و برعکس احیا شدن یک ماده سبب می گردد که پتانسیل الکتریکی آن به همان نسبت کاهش یابد. ایجاد پتانسیل های مثبت و منفی در مواد غذایی نتیجه ی وجود ترکیبات شیمیایی خاص در آن فراورده ها است. برای مثال وجود گروه های SH (سولفیدرین که از میتورین، سیتئین، سوفوریل تشکیل شده است) در گوشت و اسید آسکوربیک و قند های احیا کننده در میوه ها و سبزی ها موجب ایجاد شرایط احیا در این محصولات می شوند.
Eh فراورده های گیاهی به ویژه عصاره ی میوه ها و سبزی ها بین +300 تا +400 میلی ولت می باشد. بنابراین جای تعجب نیست که عامل اصلی فساد این گونه مواد غذایی قارچ ها و باکتری های هوازی هستند. قطعات بزرگ گوشت دارای Eh 200- میلی ولت هستند. ولی Eh گوشت چرخ کرده بین +200 تا -200میلی ولت متغیر است (در گوشت چرخ کرده به دلیل ورود هوا و بار مثبتش، در هنگام چرخ کردن Eh می تواند به این گونه متغیر بوده و محدوده ی مثبت را در برگیرد). پنیر های مختلف دارای Eh منفی بوده، مقدار Eh از -20 تا -200 میلی ولت در نوسان است.
میکروارگانیزم ها احتیاجات Eh متفاوتی دارند. میکروب های هوازی برای رشد خود، احتیاج به Eh مثبت و میکروب های بی هوازی نیاز به Eh منفی دارند. مثلا باکتری های جنس کلستریدیوم که بی هوازی هستند، وجود Eh منفی برای رشدشان ضروری است و بلعکس باکتری های جنس باسیلوس جزء گروهی هستند که احتیاج به Eh مثبت دارند. پتانسیل اکسیداسیون و احیا بسته به نوع ماده غذایی و وضعیت شیمیایی متغیر است.
بر نوع مثبت و منفی بودن Eh، نیاز اکسیژنی دخیل است به گونه ای که باسیلوس ها شدیدا هوازی (aerobe) هستند و هم چنین کلستریدیوم ها کاملا بی هوازی اند (anaerobe) و این دو دسته هر دو ترموفیل هستند.
بعضی از باکتری های هوازی عملا در شرایطی که کمی احیا شده باشد، بهتر رشد می کنند. اغلب این میکروارگانیزم ها از نوع میکروآئروفیل (micro aerophil) هستند، از این دسته لاکتوباسیلوس ها و استرپتوکوکسی ها را می توان نام برد. دسته ی دیگر میکروارگانیزم ها در شرایط هوازی و بی هوازی قادر به رشدند که به این دسته بی هوازی اختیاری (facultative anaerobe) گفته می شود.
اکثر مخمر ها و کپک ها که درون غذا یا بر سطح آن ها رشد می کنند، از انواع هوازی هستند هر چند که برخی از آن ها به شرایط بی هوازی اختیاری نیز تمایل دارند.
ترکیبات مغذی: رشد و زندگانی میکروارگانیزم ها به آن وابسته است.
منابع ترکیبات مغذی:
· منبع انرژی: منشا آن کربن است که جهت انجام واکنش ها و فعالیت ها در میکروارگانیزم ها مصرف می شود. کربن برای یک میکروارگانیزم از طریق تجزیه ی قندها، اسید های آمینه، پلی ساکاریدها، الکل ها، چربی ها بدست می آید.
میکروارگانیزم ها تمایل به سهولت زندگی دارند و در یک محلول برای بدست آوردن کربن در صورت وجود چند منبع کربنی ابتدا به سمت منبع ساده تر یعنی قند ها می روند و سپس به سراغ پلی ساکارید ها که با تجزیه آن ها به قند ها منبع کربنی خود را بدست می آورند و چربی ها با سوزاندن آن ها جهت تامین کربن، می روند.
همانطور که یک انسان در صورت نبود منبع انرژی مناسب در صورت تغذیه نادرست از غذای نامناسب آسیب می بیند (بیماری نقرس بر اثر کمبود های غذایی بوجود می آید)، یک میکروارگانیزم نیز در چنین شرایطی آسیب می بیند.
قارچ ها و کپک ها توقع کم تری نسبت به باکتری ها داشته و با کم ترین نیاز ها زندگی می کنند. در بین باکتری ها نیز باکتری های G+ حساس ترند به طوری که آن ها را باکتری های عیانی یا پرتوقع (Fastiduce) می نامند هم چنین G-ها حساسیت و تمایل کم تری دارند .
· ازت: برای تامین نیتروژن که ساختار میکروارگانیزم ها را تشکیل می دهد، میکروارگانیزم ها به سوی اسید های آمینه می روند که به اسید های آمینه، پپتید ها و پپتید ها پروتیین ها را می سازند که با توجه به این مورد پلی آمینو اسید ها یا پروتیین ها، ترکیبات پپتیدی، نوکلئوتید ها در صورت نبود، آمینو اسید منابع دیگر تامین کننده ی اسید مورد نیاز میکروارگانیزم هستند.
· املاح: به طور معمول در مواد غذایی وجود دارند و به مصرف میکروارگانیزم ها می رسند.
· ویتامین ها: بخصوص ویتامین گروه B که باید در مواد غذایی مصرفی میکروارگانیزم ها وجود داشته باشد به استثناء قارچ ها و باکتری های G- که توان سنتز ویتامین B را دارند. اما G+ ها باید حتما مواد اندکی ویتامین B را در اختیار داشته باشند تا زیست کنند.
میوه ها ویتامین B کمتری نسبت به گوشت ها و هم چنین با وجود PH پایین و Eh مثبت، قارچ ها و کپک ها عامل فساد آن ها می باشند.
· ترکیبات ضد میکروبی: در بررسی های انجام شده بر روی ترکیبات آروماتیک، گیاهان، برخی خواص میوه ها، ادویه ها به ترکیباتی ضد میکروبی پی برده شد.
برخی گونه های گیاهان دارای روغن های اساسی (Esetial oil) هستند که نقش ضد میکروبی دارند. از جمله اوژنول (Eugenol) در میخک، آلیسین (Allicin) در سیر، سینامیک آلدهید (Cinamic aldehyde) و اوژنول در دارچین و آلیل ایزوتیوسیانات (Allyl isothiocyanat) در خردل و هم چنین در میوه ها، سبزی ها، چای، ملاس و دیگر منابع گیاهی ترکیباتی چون کافئیک اسید (Coffeic acid)، کلروژنیک اسید (Cholerogenic acid)، فرونیک اسید (Feronic acid) و پی کوماریک (P-qumaric) وجود دارند که دارای خواص ضد باکتری و ضد قارچی اند. اسید های آلی موجود در میوه ها و سبزی ها مثل اسید مالیک (اسید سیر، سبزی) اسید تارتاریک (انگور، ریواس) و اسید سوبکینیک (ریواس، چغندر) نیز از دسته ی ترکیبات ضد میکروبی اند. ترکیبات اوژنول و تیمول در مریم گلی و ایزوتیمول (کاواکرول) و تیمول در پونه کوهی را نیز می توان نام برد.
شیر گاو دارای چندین ترکیب ضد میکروبی است نظیر لاکتوفرین (Lactoferin)، سیستم لاکتوپراکسیداز و ترکیبی به نام لاکتینین.
تخم مرغ نیز دارای لیزوزیم (روی پوست) است که همراه با کنالبومین در تخم مرغ موجب حفاظت از میکروارگانیزم ها می شوند.
در واکوئل گیاهانی مثل کلم، گل کلم و شلغم ترکیبی به نام گلوکز زنیلات موجود است که در اثر صدمات و تخریب مکانیکی تولید ایزوتیوسیانات می کند که این ترکیب دارای خواص ضد باکتری و ضد قارچی است.
ساختمان بیولوژیک: پوشش طبیعی برخی مواد خوراکی که محافظی خوب در برابر میکروارگانیزم ها است و از ورود آن ها به بافت های داخل جلوگیری می کند. در این مورد می توان از ساختمان پوششس داخل دانه ها و پوشش سطحی میوه ها و پوسته ی سخت محصولات روغنی مثل پسته و بادام و...، پوسته ی خارجی تخم مرغ یا غشای نازک در بردارنده ی گوشت نام برد.
عوامل خارجی:
شامل خصوصیات محیط نگهداری و انبار داری مواد غذایی می شود که این خصوصیات هم ماده ی غذایی را تحت تاثیر قرار می دهد و هم بر روی میکروارگانیزم های موجود در مواد خوراکی تاثیر می گذارد که مهم ترین این فاکتور ها عبارتند از درجه حرارت انبار، رطوبت نسبی محیط، حضور گاز های مختلف و غلظت آن ها در اتمسفر انبار و حضور سایر میکروارگانیزم ها.
درجه حرارت انبار: دامنه ی حرارتی مناسب برای میکروارگانیزم ها بسیارگسترده است. پایین ترین درجه ای که برای فعالیت میکروارگانیزم ها مشاهده شده است دمای -34 درجه ی سانتی گراد می باشد. در حالی که بالاترین دما برای فعالیتشان قدری بیش از 90 درجه ی سانتی گراد است.
میکروارگانیزم ها از نظر نیاز حرارتی به سه دسته ی کلی سرما دوست، معتدل دوست و گرما دوست طبقه بندی می شوند.
· سرما دوست ها به دو دسته ی سایکروفیل (Psychrophil) که دمای بهینه ی آن 10-15 درجه ی سانتی گراد است و هم چنین سایکروتروف (Psychrotroph) (تروف به معنی تحمل کننده است) با دمای بهینه 20-30 درجه سانتی گراد تقسیم بندی می شوند.
· معتدل دوست ها یا مزوفیل (Mesophil) که دمای بهینه ی آن ها برای تکثیر و زیست 30-40 درجه سانتی گراد است و باکتری های بیماری زا عموما در این دسته قرار می گیرند.
· گرما دوست ها که در دو دسته ی ترموفیل (Thermophil) با دمای بهینه ی بیش از 45 درجه سانتی گراد یا بالاتر و ترمودیوریک (Thermoduric) که دمای بالا را تحمل می کند و رشدی ندارند؛ تقسیم می شوند. مهم ترین باکتری های دسته ترموفیل، باسیلوس ها و کلستریدیوم ها (غذاهای کنسروی) هستند.
میکروارگانیزم های سایکروفیل و سایکروتروف در درجه حرارت یخچال به خوبی رشد و نمو می کنند و باعث فساد مواد غذایی خوراکی مثل گوشت ها، ماهی ها، فراورده های گوشتی طیور، تخم مرغ و ... می شوند. قارچ هایی نظیر آسپرژیلوس نیز در دمای یخچال فعال می مانند. مخمر ها بیشتر به شرایط سایکروفیل ها و مزوفیل ها تمایل دارند و کم تر در دامنه ی ترموفیل فعالیت می کنند.
کیفیت مواد خوراکی نیز باید در انتخاب درجه حرارت مناسب برای نگهداری آن ها مورد توجه قرار بگیرد. شاید نگهداری کلیه ی مواد خوراکی در دمای یخچال یا کم تر از آن، امر مطلوبی به نظر آید ولی گاهی چنین نیست مثلا موز در درجه حرارت 13 تا 17 درجه سانتی گراد بهتر از دمای 5 تا 7 درجه سانتی گراد قابل نگهداری است. هم چنین برای بسیاری از سبزیجات مانند سیب زمینی، کرفس و کلم سفید درجه حرارت مناسب 10 درجه سانتی گراد می باشد.
روش کشت صفحه ای حلقه ای:
این را برای مواد غذایی مایع غیر ویسکوز که دارای شمارش کلی میکروبی بیش از 3000 در هر میلی لیتر بوده یا برای مواد غذایی ویسکوز یا جامدی که دارای شمارش کلی بیش از 30000 در هر میلی لیتر می باشند، مناسب است.
مواد و لوازم مورد نیاز:
1. حلقه کشت 0/01 یا 0/001 میلی لیتر
2. محلول رقیق کننده
3. پتری دیش (پلیت)
4. محیط کشت
روش:
نمونه های ماده غذایی را بعد از آماده کردن رقیق نمایید. قبل از کشت، حلقه کشت به وسیله شعله دادن سترون کنید و بگذارید به مدت 15 ثانیه خنک شود. به دقت حلقه کشت را در داخل رقت مورد نظر وارد کنید. سعی نمایید که از حلقه قطرات مایع به خارج پراکنده نشود. سر پوش پتری دیش را برداشته و مایع درون حلقه را به داخل آن منتقل کنید و سپس مقدار 12 تا 15 میلی لیتر آگار اضافه کرده و در انکوباتور قرار دهید.
جهت محاسبه و شمارش پرگنه ها در صورتی که از حلقه 0/01 میلی لیتر استفاده شده است مقدار نمونه داخل پتری دیش معادل 100 بار رقیق کردن است. یعنی اگر 0/01 میلی لیتر از رقت 0/1 ماده غذایی استفاده شده است. رقت نهایی 0/001 خواهد بود. در صورت استفاده از حلقه کشت با اندازه 0/001 میلی لیتر رقت نهایی 0/0001 خواهد بود.
منبع: کتاب آزمون میکروبی مواد غذایی، دکتر گیتی کریم، انتشارات دانشگاه تهران، چاپ دوم 1374
روش کشت صفحه ای سطحی(روش پخش قطره ای)
الف: لوازم مورد نیاز:
1. برای آماده سازی نمونه و تهیه رقت از ماده غذایی همگن شده استفاده می شود.
2. پلیت های شیشه ای (10 x 15 mm) یا پلاستیکی (9 x 15 mm)
3. پیپت های باکتریولوژی به اندازه های 1، 5 و 10 میلی لیتر
4. حمام آب گرم یا گرمخانه دارای تهویه جهت گرم نگه داشتن محیط کشت در حرارت 46-44 درجه سانتی گراد
5. گرمخانه 31-2 درجه سانتی گراد (توجه: ثبات و یکنواختی درجه حرارت گرمخانه همیشه یکسان نیست). برای کنترل ثبات درجه حرارت گرمخانه به وسیله ترموکوپل یا گرماسنج های مناسب در ساعات مختلف و متعدد حرارت داخلی گرمخانه را به طور مکرر اندازه گیری کنید. برای کنترل یکنواختی حرارت در ساعات مختلف باید حرارت نقاط مختلف گرمخانه را هنگامی که پر از پلیت های کحشت است اندازه گرفت. ستون های پتری دیش را در داخل گرمخانه باید با فاصله مناسب از یکدیگر و از دیواره ها و سقف گرمخانه قرار داد. (هر ستون نباید از پیش از شش پتری دیش و ترجیحا 4 عدد تشکیل شده باشد).
6. پرگنه شمار
7. محیط کشت پلیت کانت آگار یا محیط کشت استاندارد متد آگار
8. محفظه خشک کن یا گرمخانه برای خشک کردن سطح محیط های کشت که ترجیحا در 50 در جه سانتی گراد انجام می گیرد.
9. پخش کننده های شیشه ای (میله های شیشه ای سرعصایی شکل)
10. پیپت مدرج باکتریولوژیک به حجم یک میلی متر با درجه بندی 1/0 میلی لیتر یا کمتر
ب: روش:
1. 15 میلی لیتر از محیط ذوب شده و خنک شده (45-60 درجه سانتی گراد) پلیت کانت آگار را به هر پلیت افزوده و بگذارید تا جامد شود. پلیت های حاوی محیط کشت را به مدت 5/1 تا 2 ساعت در حرارت 50 درجه سانتی گراد قرار دهید تا خشک شوند. اگر پلیت ها قبلا آماده شده است، نباید بیش از 24 ساعت در حرارت اتاق یا 7 روز در یخچال 5-2 درجه سانتی گراد نگهداری شوند.
2. مقدار 1/0 میلی لیتر از هر رقت نمونه ماده غذایی آماده شده را به وسیله یک پیپت یک میلی لیتری برداشته و به سطح محیط کشت منتقل کنید. (حداقل از سه رقت استفاده نمایید) از بالاترین رقت شروع کرده و ادامه دهید. قبل از انتقال 1/0 میلی لیتر نمونه سه بار پیپت را پر و خالی کنید، در این صورت در طول مراحل کشت فقط از یک پیپت استفاده نمایید.
3. با استفاده از میله شیشه ای پخش کننده به سرعت مقدار 1/0 میلی لیتر نمونه رقیق شده را در سطح محیط کشت پخش کنید (برای هر پلیت از یک میله شیشه ای مجزا استفاده نمایید) بگذارید که سطح پلیت ها برای 15 دقیقه خشک شوند.
4. پلیت ها را به طور وارونه در گرمخانه (انکوباتور) قرار دهید. (31-29 درجه سانتی گراد به مدت 3 روز)
5. شمارش کشت سطحی:
الف: دو پلیت از یک رقت را که دارای 30 تا 300 پرگنه است انتخاب کرده و با استفاده از پرگنه شمار تمام پرگنه ها را شمارش کنید. میانگین حسابی دو شمارش را که در ضریب رقت ضرب کرده اید را محاسبه کنید و عدد حاصل را به عنوان شمارش کلی میکروب ها گزارش نمایید.
ب: در این روش حتما باید دو پلیت شمارش شوند، حتی اگر یکی از آن ها دارای کمتر از 30 یا دیگری بیش از 300 پرگنه باشد.
ج: اگر دو رقت متوالی دارای 300 – 30 پرگنه باشند، برای هر کدام از رقت ها پرگنه ها را شمارش و میانگین دو رقت را مطابق آنچه گفته شد بدست می آورید، مگر این که پرگنه های رقت بالاتر ، بیش از دو برابر رقت پایین تر باشد. در این صورت شمارش پرگنه در رقت پایین تر را به عنوان شمارش کلی میکروبی گزارش کنید:
6. محاسبه تخمینی شمارش کلی میکروبی
الف: اگر پرگنه های هر پلیت بین 30 تا 300 عدد نباشد، شمارش را به عنوان تخمین شمارش کلی گزارش و به شرح زیر محاسبه کنید:
ب: اگر در تمام رقت ها بیش از 300 پرگنه در هر پلیت دیده شود، سطح هر پلیت را به شعاع های مناسب تقسیم و پرگنه ها را در یک قسمت یا بیشتر شمارش کنید، سپس تعداد کل را در ضریب مناسب ضرب نمایید. میانگین شمارش را در دو پلیت محاسبه کرده و در ضریب رقت ضرب و نتیجه را به عنوان تخمین شمارش کلی گزارش کنید.
ج: اگر تعداد پرگنه ها در یک قسمت از 8 قسمت پلیت مربوط به بالاترین رقت از 200 بیشتر است (200 x 8 = 1600)، آن را در ضریب رقت ضرب کرده و عدد حاصل را به صورت بیشتر از (<) به عنوان تخمین شمارش کلی گزارش کنید. در تمام موارد توصیه می شود که رقت را در پرانتز ذکر نمایید.
د: موقعی که در پلیت های کشت شده از غلیظ ترین رقت پرگنه ای دیده نمی شود. شمارش تخمینی را کمتر از (>) نیم برابر رقت گزارش شود.
7. محاسبه و گزارش نتایج: فقط دو رقم معنی دار باید در گزارش شمارش استاندارد میکروبی و شمارش تخمینی میکروبی بیان شود که این دو رقم اولین و دومین رقم از سمت چپ میانگین شامرش ها بوده و سایر ارقام با صفر بیان می شود. به عنوان مثال اگر شمارش 523000 باشد، به صورت 52 x 104 گزارش می گردد. اگر سومین رقم از سمت چپ 5 یا بیشتر باشد، یک واحد به دو رقم اضافه می شود. به عنوان مثال اگر شمارش 83600 باشد، ان را به صورت 84000 یا 84 x 103 بیان کنید.
8. بازدارنده ها: وجود بازدارنده ها مخصوصا در مواردی که رقت های پایین تر به طور محسوسی کمتر از میزان مورد انتظار است، مورد شک قرار می گیرد. در این صورت آزمایش های مختلفی برای تشخیص وجود بازدارنده های احتمالی باید مورد توجه قرار گیرد.
9. گزارش و تفسیر نتایج:
الف: حسب مورد شمارش ها را به عنوان شمارش صفحه ای استاندارد (SPC) یا شمارش کلی تخمینی (ESPC) در یک ماده غذایی بیان کنید.
ب: هنگامی که آزمایش شمارش کلی برای تصمیم گیری در مورد قبول یا رد یک محموله غذایی مورد استفاده قرار گیرد، فقط باید از روش (SPC) استفاده شود و هرگز نباید از شمارش کلی تخمینی استفاده نمود.
از نظر سازمان های کنترل کننده ی روش (ESPC) فقط به عنوان نتیجه گیری تقریبی اولیه و برای ارزیابی کیفیت میکروبی ماده غذایی مفید است.
10. قابلیت تکرار و خطا فردی: شمارش مجدد یک پلیت اگر توسط آزمایشگر قبلی انجام شود، باید حداکثر 5 درصد شمارش اولیه و موقعی که توسط شخص دیگری انجام می شود، حدود 10 درصد شمارش اولیه اختلاف داشته باشد. اگر تغییرات بیش از این حدود باشد، ممکن است علل مختلفی مانند ضعف دید، اشکال در تشخیص پرگنه های ریز یا معمولا اشکال در تشخیص پرگنه ها و تفکیک آن ها از ذرات غذا سبب آن باشد.
منبع: کتاب آزمون میکروبی مواد غذایی، دکتر گیتی کریم، انتشارات دانشگاه تهران، چاپ دوم 1374
Total Count Bacteria
شمارش میکروارگانیزم های زنده، هوازی و مزوفیل
روش شمارش صفحه ای استاندارد:
الف- لوازم و مواد مورد نیاز
1. برای آماده سازی نمونه و تهیه رقت از ماده غذایی همگن شده استفاده می شود.
2. پلیت های شیشه ای (10 x 15 mm) یا پلاستیکی (9 x 15 mm)
3. پیپت های باکتریولوژی به اندازه های 1، 5 و 10 میلی لیتر
4. حمام آب گرم یا گرمخانه دارای تهویه جهت گرم نگه داشتن محیط کشت در حرارت 46-44 درجه سانتی گراد
5. گرمخانه 31-2 درجه سانتی گراد (توجه: ثبات و یکنواختی درجه حرارت گرمخانه همیشه یکسان نیست). برای کنترل ثبات درجه حرارت گرمخانه به وسیله ترموکوپل یا گرماسنج های مناسب در ساعات مختلف و متعدد حرارت داخلی گرمخانه را به طور مکرر اندازه گیری کنید. برای کنترل یکنواختی حرارت در ساعات مختلف باید حرارت نقاط مختلف گرمخانه را هنگامی که پر از پلیت های کحشت است اندازه گرفت. ستون های پتری دیش را در داخل گرمخانه باید با فاصله مناسب از یکدیگر و از دیواره ها و سقف گرمخانه قرار داد. (هر ستون نباید از پیش از شش پتری دیش و ترجیحا 4 عدد تشکیل شده باشد).
6. پرگنه شمار
7. محیط کشت پلیت کانت آگار یا محیط کشت استاندارد متد آگار
ب- روش
1. نمونه ماده غذایی را آماده و رقیق کنید.
2. به دو سری پتری دیش مقدار یک میلی لیتر از رقت های 10-1 و 10-2 و 10-3 و 10-4 و 10-5 و مقدار 1/0 میلی لیتر از رقت 10-5 را منتقل کنید (این ترتیب در مواقعی که تعداد باکتری های نمونه ماده غذایی را نمی توان تخمین زد اجرا می گردد). هنگامی که حدود تقریبی تعداد میکروب ها در یک گرم یا یک میلی لیتر ماده غذایی مشخص نمی باشد، حداقل سه پلیت از رقت باید کشت داده شود.
3. محیط کشت پلیت کانت آگار را در معرض جریان بخار یا آب جوش ذوب کنید. (برای مدت طولانی محیط را در این حرارت قرار ندهید). حرارت محیط کشت را به 46-44 درجه سانتی گراد برسانید و بعد از کنترل درجه حرارت به طوری که 8 باکتری ها در نمونه رقیق شده از بین نروند، بلافاصله مقدار 15-10 میلی لیتر از محیط کشت را در پتری دیش ها بریزید. سعی کنید که فاصله زمانی بین تهیه رقت ها و ریختن محیط کشت کمتر از 20 دقیقه و ترجیحا کمتر از 10 دقیقه باشد.
4. بلافاصله نمونه های رقیق شده و محیط کشت را تکان داد و چرخاندن پلیت ها مخلوط کنید. بدین ترتیب که ابتدا پلیت ها را پنج بار در جهت عکس عقربه های ساعت و 5 بار در جهت عقربه های ساعت چرخانده و پنج بار عمودی و پنج بار افقی آن ها تکان دهید.
5. برای کنترل سترون بوده محیط های کشت و پلیت ها از محیط کشت و محلول رقیق کننده شاهد استفاده کنید.
6. بعد از این که محیط های کشت به صورت جامد درآمد، پلیت را به طور وارونه در گرمخانه 31-29 درجه سانتی گراد به مدت 48 ساعت قرار دهید.
7. شمارش کلی میکروبی (Total count) استاندارد را طبق بند 8 و 9 تعیین نمایید.
8. محاسبه شمارشکلی میکروبی استاندارد:
الف: دو پلیت از یک رقت را که دارای 30 تا 300 پرگنه است انتخاب کرده و با استفاده از پرگنه شمار تمام پرگنه ها را شمارش کنید. میانگین حسابی دو شمارش را که در ضریب رقت ضرب کرده اید را محاسبه کنید و عدد حاصل را به عنوان شمارش کلی میکروب ها گزارش نمایید.
ب: در این روش حتما باید دو پلیت شمارش شوند، حتی اگر یکی از آن ها دارای کمتر از 30 یا دیگری بیش از 300 پرگنه باشد.
ج: اگر دو رقت متوالی دارای 300 – 30 پرگنه باشند، برای هر کدام از رقت ها پرگنه ها را شمارش و میانگین دو رقت را مطابق آنچه گفته شد بدست می آورید، مگر این که پرگنه های رقت بالاتر ، بیش از دو برابر رقت پایین تر باشد. در این صورت شمارش پرگنه در رقت پایین تر را به عنوان شمارش کلی میکروبی گزارش کنید:
9. محاسبه تخمینی شمارش کلی میکروبی
الف: اگر پرگنه های هر پلیت بین 30 تا 300 عدد نباشد، شمارش را به عنوان تخمین شمارش کلی گزارش و به شرح زیر محاسبه کنید:
ب: اگر در تمام رقت ها بیش از 300 پرگنه در هر پلیت دیده شود، سطح هر پلیت را به شعاع های مناسب تقسیم و پرگنه ها را در یک قسمت یا بیشتر شمارش کنید، سپس تعداد کل را در ضریب مناسب ضرب نمایید. میانگین شمارش را در دو پلیت محاسبه کرده و در ضریب رقت ضرب و نتیجه را به عنوان تخمین شمارش کلی گزارش کنید.
ج: اگر تعداد پرگنه ها در یک قسمت از 8 قسمت پلیت مربوط به بالاترین رقت از 200 بیشتر است (200 x 8 = 1600)، آن را در ضریب رقت ضرب کرده و عدد حاصل را به صورت بیشتر از (<) به عنوان تخمین شمارش کلی گزارش کنید. در تمام موارد توصیه می شود که رقت را در پرانتز ذکر نمایید.
د: موقعی که در پلیت های کشت شده از غلیظ ترین رقت پرگنه ای دیده نمی شود. شمارش تخمینی را کمتر از (>) نیم برابر رقت گزارش شود.
10. محاسبه و گزارش نتایج: فقط دو رقم معنی دار باید در گزارش شمارش استاندارد میکروبی و شمارش تخمینی میکروبی بیان شود که این دو رقم اولین و دومین رقم از سمت چپ میانگین شامرش ها بوده و سایر ارقام با صفر بیان می شود. به عنوان مثال اگر شمارش 523000 باشد، به صورت 52 x 104 گزارش می گردد. اگر سومین رقم از سمت چپ 5 یا بیشتر باشد، یک واحد به دو رقم اضافه می شود. به عنوان مثال اگر شمارش 83600 باشد، ان را به صورت 84000 یا 84 x 103 بیان کنید.
11. بازدارنده ها: وجود بازدارنده ها مخصوصا در مواردی که رقت های پایین تر به طور محسوسی کمتر از میزان مورد انتظار است، مورد شک قرار می گیرد. در این صورت آزمایش های مختلفی برای تشخیص وجود بازدارنده های احتمالی باید مورد توجه قرار گیرد.
12. گزارش و تفسیر نتایج:
الف: حسب مورد شمارش ها را به عنوان شمارش صفحه ای استاندارد (SPC) یا شمارش کلی تخمینی (ESPC) در یک ماده غذایی بیان کنید.
ب: هنگامی که آزمایش شمارش کلی برای تصمیم گیری در مورد قبول یا رد یک محموله غذایی مورد استفاده قرار گیرد، فقط باید از روش (SPC) استفاده شود و هرگز نباید از شمارش کلی تخمینی استفاده نمود.
از نظر سازمان های کنترل کننده ی روش (ESPC) فقط به عنوان نتیجه گیری تقریبی اولیه و برای ارزیابی کیفیت میکروبی ماده غذایی مفید است.
13. قابلیت تکرار و خطا فردی: شمارش مجدد یک پلیت اگر توسط آزمایشگر قبلی انجام شود، باید حداکثر 5 درصد شمارش اولیه و موقعی که توسط شخص دیگری انجام می شود، حدود 10 درصد شمارش اولیه اختلاف داشته باشد. اگر تغییرات بیش از این حدود باشد، ممکن است علل مختلفی مانند ضعف دید، اشکال در تشخیص پرگنه های ریز یا معمولا اشکال در تشخیص پرگنه ها و تفکیک آن ها از ذرات غذا سبب آن باشد.
منبع: کتاب آزمون میکروبی مواد غذایی، دکتر گیتی کریم، انتشارات دانشگاه تهران، چاپ دوم 1374
عوامل دورنی:
PH: حداکثر رشد میکروارگانیزم ها در 7=PH صورت می گیرد. (6/6 تا 5/7) با این وجود برخی از آن ها در PH کم تر از 4 نیز قابل رشدند. باکتری ها نسبت به قارچ ها و مخمر ها حساسیت بیشتری در مقابل تغییرات PH نشان می دهند و این خصوصیات در باکتری های پاتوژن (بیماری زا) نمود بیشتری دارند. زیرا PH بدن انسان خنثی است، مگر در صورتی که جهش های ژنی اتفاق بیافتد تا حساسیت کم تری نشان دهند.
باکتری ها در دو دسته ی مفید و غیر مفید قرار می گیرند. باکتری های غیر مفید عامل فساد هستند.
حدود دقیق PH رشد میکروارگانیزم ها به سایر عوامل موثر در رشد میکروارگانیزم ها بستگی دارد. به عنوان مثال حداقل PH قابل تحمل برای برخی سویه های لاکتوباسیلوس به نوع اسید موجود در محیط وابسته است. این سویه ها در مجاورت اسید های سیتریک، کلریدریک، فسفریک و تارتاریک (موجود در انگور) می توانند PH پایین تری را تحمل کنند و نسبت به زمانی که در محیط اسید لاکتیک و استیک وجود داشته باشد.
در رابطه با PH رشد میکروارگانیزم ها، PH ماده غذایی نیز اهمیت دارد. مثلا میوه ها غالبا بوسیله ی کپک ها و مخمر ها مورد حمله قرار می گیرند. میوه ها که بیشتر شرایط اسیدی دارند و PH کم تر از 4 دارند، کم تر مورد حمله ی میکروب قرار می گیرند. چرا که این موجودات در pH کم تر از 5/3 نیز قادر به فعالیتند. اکثر سبزی ها در مقایسه با میوه ها PH بالاتری دارند و در نتیجه مورد حمله ی باکتری ها قرار می گیرند. هر چند کپک و مخمر نیز می توانند بر روی سبزی ها تاثیر گذار باشند. اما باکتری ها توان بیشتری بر تاثیر گذاری بر سبزی نسبتا به کپک ها و مخمر ها دارند، زیرا بهتر می توانند از ترکیبات مغذی استفاده کنند. هم چنین PH نهایی محصولات گوشتی در فراورده های دریایی در محدوده ی 6/5 و بالاتر واقع است، به همین جهت این محصولات دچار فساد باکتریایی و نیز فساد ناشی از کپک ها و مخمر ها می شوند.
در بحث دام های ذبح شده، دام ها را باید قبل از ذبح خوب غذا داد و بیشتر استراحت داد، زیرا در زمانی که استراحت بیشتری داشته باشند، گوشت آن ها ماندگاری بیشتری دارد، زیرا زمانی که دام دارای تحرک باشد، ذخیره گلیکوژنی آن که مورد حمله ی میکروارگانیزم هاست زود تمام شده و زمانی که ذبح شود، با ورود میکروارگانیزم ها و حمله به ذخیره ی گلیکوژنی ناکافی و کاهش تولید اسید لاکتیک (اسیدی که پس از تحرک از بافت های گوشتی بدن خارج می شود) باکتری ها دیگر عامل مزاحمی برای رشدشان را در پیش رو نخواهند داشت و به فساد گوشت دام می انجامد. اما زمانی که دام خوب استراحت کند اسید لاکتیک کافی برای از بین رفتن میکروارگانیزم ها وجود دارد. اسید لاکتیک عامل کاهش شرایط PH و ایاد عامل مزاحمی است.
در حالت کلی وجود ذخیره گلیکوژنی همراه است با وجود اسید لاکتیک و با وجود اسید لاکتیک، PH کاهش یافته و شرایط رشد میکروارگانیزم ها نامساعد می شود.
وقتی میکروارگانیزم ها در یک ماده ی غذایی رشد می کنند و از مواد مغذی آن ها استفاده می کنند، PH را تغییر می دهند به این صورت که بعضی میکروب ها اسید دوستند و با مصرف اسید موجود در غذا، PH افزایش می یابد و گاهی نیز با مصرف مواد مغذی موجود در مواد غذایی موجب کاهش PH می شوند. مانند مصرف ذخیره گلیکوژنی و مصرف اسید لاکتیک در دام ذبح شده.
وقتی میکروارگانیزم فعالیت می کند، تغییر PH در هر شرایط غذایی یکسان نیست، زیرا با توجه به نوع ترکیبات غذایی موجود در مواد و هم چنین نوع ساختار مواد غذایی، به طور مثال در محصولات گوشتی، پروتیین زیادی وجود دارد و خاصیت بافری وجود دارد ولی در سبزیجات به علت پروتیین کم تر این عمل کم تر اتفاق می افتد.
برخی مواد غذایی در مقابل تغییر PH مقاومند که به این گونه محیط هایی بافر گویند، مثل ترکیبات گوشتی که بهتر از سبزیجات نوسانات PH را تحمل می کنند. حالت بافری گوشت ها به دلیل وجود ترکیبات پروتیینی مختلف در آن هاست. سبزیجات معمولا به دلیل پروتیین کم، ظرفیت بافری کم تری دارند، به همین دلیل در مقابل نوسانات PH که در نتیجه ی رشد میکروارگانیزم ها بوجود می آید، مقاومت چندانی ندارد.
پروتیین ها در PH خاصی، شکل خاصی دارند و با تغییر PH شکل پروتیین ها تغییر می کند که به این عمل تغییر شکل، دناتوره می گویند. مانند تبدیل شیر به ماست، زمانی که لاکتوز به اسید لاکتیک تبدیل می شود موجب ترش شدن شیر می شود که این عمل زمانیست که تبدیل شیر به ماست درست اتفاق نیافتد.
رطوبت: برای نگهداری مواد غذایی در مدت طولانی از روش هایی نظیر فریز کردن، خشک کردن، نمک کردن، دودی کردن استفاده می شود که رطوبت را از ماده و از دسترس میکروارگانیزم خارج می کند.
خشک کردن مواد غذایی یکی از قدیمی ترین روش هایی است که بشر برای نگهداری این نحصولات به کار می گیرد. در این روش افزایش طول نگهداری، نتیجه ی مستقیم دور کردن آب از فراروده است.
رطوبت به گونه ای بر میکروارگانیزم ها تاثیر می گذارد که به طور مثال حتی وقتی تمام شرایط دیگر در حالت اپتیمم (بهینه) باشند و رطوبت کافی نباشد، میکروارگانیزم توان رشد کردن را ندارد.
امروزه این موضوع که کلیه ی میکروارگانیزم ها برای فعالیتشان نیاز به رطوبت نسبی مشخصی دارند به صورت یک اصل پذیرفته شده که البته انواع مختلف میکروارگانیزم ها دارای نیاز های رطوبتی متفاوتی هستند. در اصطلاح علمی به این نیاز رطوبتی فعالیت آبی (water activity) گفته می شود که با نماد aw نیز نشان داده می شود. در یک محیط، فعالیت آبی بدین ترتیب تعریف می شود: که نسبت فشار بخار آب در ماده ی غذایی در دمای معین به فشار بخار آب خالص در همان دما
aw = P / P0 (P=فشار بخار آب ماده ی غذایی , P0=فشار بخار آب خالص)
RH = aw * 100 (RH=رطوبت نسبی)
آب در ترکیبات غذایی در سه دسته ی تک لایه ((Mono layer) بین مولکول های مواد غذایی است و غیر قابل جدا شدن و غیر قابل دسترس است)، لایه نشر ((Diffusion layer) در حدود 800آنگستروم است و تحت جاذبه ی مولکول های مواد غذایی است و جدا سازی این لایه به روش های سخت صورت می پذیرد)، آب آزاد ((Free water) آب دسترس میکروارگانیزم ها است و aw نیز در همین بخش قرار می گیرد)
در بحث آب به دو مسئله بر می خوریم که یکی موجودیت آب و دیگری میزان آب است که میزان آب هر سه بخش آب را در بر می گیرد و موجودیت آب تنها بخش آب آزاد را در بر می گیرد.
میزان aw برای اکثر مواد غذایی خام و تازه در حدود 99/0 است که بسیاری از میکروارگانیزم ها، محیط های کاملا مرطوب را ترجیح می دهند.
نیاز آبی برای انجام فعالیت های حیاتی کپک و مخمر نسبت به باکتری ها کم تر است. اکثر باکتری های در کم تر از 91/0 قادر به رشد نیستند. البته در این زمینه استثنائاتی وجود دارد، مثلا استافیلوکوکوس اورئوس در aw=0/86 (84/0) تکثیر می کند. قارچ ها و مخمر ها در مقایسه با باکتری ها در طیف گسترده تری از aw می توانند رشد کنند. پایین ترین میزان aw برای فعالیت باکتری ها 75/0 است که برای باکتری های نمک دوست (Holophilic bacteria) گزارش شده در حالی که انواع قارچ ها و مخمر های خشکی دوست (Xerophil) در aw=0/65 و مخمر های غلظت دوست (Osmophil) در aw=0/6 تکثیر می یابند. وقتی aw کم تر از حد مورد نیاز باکتری شود، میزان رشد کم می شود.
در زمان خشک کردن مواد غذایی، باکتری در حالت کمون یا فاز تاخیری (lag phase) قرار می گیرد تا شرایط رشد باکتری ایجاد شود. به طور کلی کاهش aw به نحوی که مقدارش از حد مطلوب برای میکروب ها کم تر باشد، سبب طولانی تر شدن فاز کمون می شود و در مرحله ی بعد این عامل سبب می شود تا از سرعت رشد و اندازه ی سلول میکروارگانیزم نیز کاسته شود. با تمام این اوصاف باید به خاطر داشته باشیم که aw تحت تاثیر پارامترهای دیگری مانند PH، درجه حرارت و .. است.
عواملی که aw را تحت تاثیر قرار می دهند، عبارتند از:
1. ترکیبات حل شده در حلال ها، نظیر قند ها و نمک ها در حلال. در بعضی از مواد غذایی، غلظت قند و نمک به حدی بالاست که ممکن است، عامل خروج آب از پیکره ی میکروبی شود. نمک در این زمینه قوی تر از قند عمل می کند. به عنوان مثال هرگاه جهت کنترل aw ار کلرور سدیم و کلرور کلسیم استفاده شود، بهتر می توان از رویش اسپور باسیلوس ها و کلستریدیوم ها جلوگیری کرد، در حالی که اثر بازدارندگی گلوکز و سوربیتول (قندی است که از اضافه شدن هیدروکسیل به یک گلوکز، طی واکنش های شیمیایی ایجاد می شود) کم تر است.
2. وجود عوامل آب دوست مثل پکتین، نشاسته، آگار به طور مثال در محیطی که سه تا چهار درصد آگار باشد، باعث توقف میکروب ها می شود. در ژله علی رقم آن که درصد رطوبت بالاست، به دلیل حضور پکتین، آب به طور پیوسته و متصل به بپپکتین بوده و نمی تواند در اختیار میکروارگانیزم ها قرار بگیرد.
3. آب کریستاله و هیدراته، برای میکروارگانیزم ها قابل استفاده نیست، هرچه درجه حرارت پایین بیاید، aw کم تر می شود، چون آب یخ می زند و غلظت مواد در پیکره ی میکروبی افزایش می یابد. به طور مثال aw آب خالص در صفر درجه ی سانتی گراد 985/0 ، در دمای 10 درجه ی سانتی گراد 907/0 و در 20 درجه ی سانتی گراد 823/0 است. در خصوص شرایطی که می توانند روی aw حداقل مورد نیاز برای میکروارگانیزم های مختلف اثر گذارد، عوامل ذیل دخالت دارد:
· نوع ترکیب مواد غذایی: برخی از میکروارگانیزم ها در رابطه با نوع ترکیبات مواد غذایی حداقل نیاز به aw در آن ها تغییر می کند. قارچ ها در این ارتباط حساس نیستند اما بعضی از باکتری ها عکس العمل نشان می دهند. برای مثال حساسیتباکتری ها نسبت به aw هنگامی که در محیط سولفات سدیم موجود باشد، بیشتر از حالتی است که در محیط کلرید سدیم موجود باشد و کلرید سدیم نیز از کلرید کلسیم بیشتر باشد.
Na2SO4 > NaCl > KCl
· ارزش غذایی محیط کشت: در محیط های کشتی که از نظر نیاز تغذیه ای برای میکروارگانیزم شرایط بهینه است، میکروب نسبت به تغییرات aw مقاوم تر می باشد.
· درجه حرارت: هر قدر از درجه حرارت بهینه ی رشد میکروارگانیزم دور شویم، حساسیت آن در مقابل مقادیر aw بیشتر می شود.
· PH: در PH بهینه، در رشد میکروارگانیزم عکس العمل نسبت بهتغییرات aw کاهش می یابد.
· اکسیژن: میکروب های هوازی در حضور O2، میزان aw کم تری را تحمل می کنند. در خصوص باکتری های غیر هوازی، عکس این مطلب صادق است.
· ترکیبات بازدارنده: حضور ترکیبات بازدارنده، سبب افزایش حداقل میزان aw مورد نیاز جهت رشد میکروارگانیزم می شود.
مقدمه و تاریخچه
هر چند تاریخ دقیقی از آگاهی بشر در مورد رشد، حضور و نقش رشد میکروارگانیزم ها در مواد غذایی در دسترس نیست، شواهد موجود نشان می دهد، بشر قبل از کشف علم میکروبیولوژی از حضور موجودات ذره بینی در مواد غذایی و تغییراتی که این موجودات ایجاد می کنند آگاهی داشت.
دوران قبل از شناخت، علومی نظیر باکتریولوژی، دوران قبل از علوم جدید (Prescientificera) نام گرفت. دوران قبل از علوم جدید خود به دو دوره ی جمع آوری مواد غذایی (Food gathering period) و دوره ی تولید مواد غذایی (Food producing period) تقسیم می شود.
دوره جمع آوری مواد غذایی از زمان خلقت بشر یعنی از یک میلیون سال قبل تا بیش از 8 هزار سال قبل می باشد که در طول این دوره احتمالا انسان گوشت خوار بوده و به تدریج از مواد غذایی گیاهی در برنامه غذایی خود استفاده کرد. احتمالا انسان در همین دوره فن پخت و پز را برای اولین بار آموخته است.
دوره تولید مواد غذایی، ضاهرا از 8 تا 10 هزار سال قبل شروع شده و تا حال ادامه داشته است. مشکل فساد و مسمومیت های غذایی در همین دوره مطرح شد و مسائلی چون انتقال بیماری ها توسط مواد غذایی و فساد آن ها به دلیل روش های نامناسب نگهداری با پیدایش غذاهای آماده بیشتر شد.
فساد مواد غذایی آماده، ظاهرا از 6 هزار سال قبل از میلاد مسیح شناخته شد. اولین دیگ های بخار در حدود 8 هزار سال قبل در خاور نزدیک ساخته شده است و هنر طباخی غلات، آبجو سازی و نگهداری مواد غذایی در همین دوره شروع گردیده و توسعه یافت. بنابر شواهد موجود بابلی ها اولین کسانی بودند که در حدود 7 هزار سال قبل از میلاد مسیح، دست اندرکار تهیه و ساخت آبجو بودند. عقیده بر این است که حدود 3 هزار سال قبل از میلاد، سامری ها به پرورش دام و تهیه مواد لبنی پرداختند. هم چنین گزارش هایی مبنی بر استفاده از شیر یا کره و پنیر توسط مصری ها در همان زمان موجود است.
یهودی ها نیز نمک بدست آمده از دریا را برای محافظت مواد غذایی مختلف استفاده می کردند و چینی ها و یونانی ها در این سال ها از نمک در تولید غذاها استفاده می کردند.
در حدود 3500 سال پیش از میلاد مسیح انواع شراب توسط آشوری ها تهیه شد. بابلی ها و مردم چین باستان در حدود 1500 سال قبل از میلاد مسیح، سوسیس های تخمیری را تهیه و استفاده می کردند. سایر روش های نگهداری مواد غذایی که در خلال این دوره مورد استفاده قرار گرفته، عبارتند از استفاده از روغن کنجد و زیتون.
روس ها در حدود هزار سال قبل از میلاد مسیح در نگهداری انواع گوشت به استثناء گوشت گوساله مهارت داشتند و بنا بر نظریه یکی از فلاسفه یونان از برف برای طولانی تر کردن زمان نگهداری گوشت ها و مواد غذایی فساد پذیر استفاده می کردند.
دود دادن گوشت ها به عنوان یک طریقه ی نگهداری و ممانعت از فساد و هم چنین تهیه و ساخت پنیر در خلال این دوره بوجود آمد. ظاهرا پیشرفت های اندکی در جهت درک و شناخت علت مسمومیت و فساد مواد غذایی از زمان تولد مسیح تا 11 قرن بعد از آن که مسمومیت ارگوت (Ergot poisoning) شناخته شد، صورت گرفت. مسمومیت ارگوت توسط قارچی به نام Claviceps که بر روی چادار و سایر حبوبات رشد می کند، بوجود می آید که منجر به مرگ و میر متعدد طی سالهای قرون وسطی شد. به طوری که در سال 1943 میلادی بیش از چهل هزار فرانسوی توسط مسمومیت ارگوت درگذشتند. علت اصلی این مسمومیت که یک توکسین (Toxin، سم) قارچی است که هنوز در آن زمان شناخته نشده بود.
بنابر گزارش های موجود در سال 1156 میلادی، قصابان با گوشت های قابل فروش و غیر قابل فروش آشنا شدند و در سال 1276 قانونی جهت ذبح و بازرسی گوشت برای کشتارگاه های عمومی آکسبورگ تدوین شد. انسان در اواخر قرن 13 به خصوصیات کیفی گوشت آگاه بود. اما این سوال مطرح است که آیا انسان در در آن زمان به رابطه ی بین کیفیت گوشت و میکروارگانیزم ها واقف بوده است یا خیر؟
اولین کسی که احتمالا به تاثیر میکروارگانیزم ها در فساد مواد غذایی اشاره کرد، راهبی به نام کیرچر (Kirchir) بوده است. او در سال 1658 میلادی مواد فساد پذیری نظیر گوشت، شیر و ... را بررسی کرد و موجودات زنده ای که با چشم غیر مسلح رویت کرد، کرم نامید و توضیحات این کشیش دقیق نبود و مشاهداتش هم مورد قبول قرار نگرفت. پس از آن شخصی به نام اسپالانزانی (Spallanzani) در سال 1765 میلادی نشان داد، آب گوشت گوساله ای که به مدت یک ساعت جوشانده و سپس به خوبی درب بندی شده بود، به صورت استریل باقی مانده و فاسد نمی گردد. اسپالانزانی این آزمایش را برای رد تئوری تولید مثل خود به خودی انجام داد. او با این وجود نتوانست منتقدان این نظریه را متقاعد سازد، زیرا آن ها بر این عقیده بودند که اسپالانزانی اکسیژنی را که برای تولید مثل خود به خودی ضروری بوده را از محیط خارج کرده است. بعد ها فرد دیگری به نام شوان در سال 1837 میلادی نشان داد که محلول های حرارت داده شده در حضور هوا استریل باقی می ماند. هدایت هوا از طریق مارپیچ هایی حرارت داده شده به محلول ها انجام شد. اگر چه هر دو محقق فوق معتقد به حفاظت غذا از فساد توسط حرارت دیدن بودند اما نتوانستند کاربرد اصلی حرارت را در این زمینه توجیه کنند.
واقعه ای که منجر به بروز بسته بندی مواد غذایی در قوطی شد بدین قرار است که حکومت فرانسه یک جایزه ی 12 هزار فرانکی برای کشف یک روش قابل قبول و علمی جهت نگهداری مواد غذایی پیشنهاد کرد. در این دوره یک قناد پاریسی به نام نیکولاس آپرت (Nicholas Appert) در سال 1809 میلادی موفق شد که گوشت را در داخل ظرف شیشه ای که طی دوره های زمانی مختلف حرارت دیده بودند، نگهداری کند. این کشف از سال 1810 به بعد، صورتی عام پذیرفت و کشف این قناد پاریسی همان طور که امروزه مشخص شده، مبدا صنعت کنسرو سازی محسوب می شود. این روش مدت ها با عنوان اپرتیزیشن (Appertization) شناخته می شد. محقق دیگری به نام لئون هوک (Leeuiwen Hook) در سال 1683 در هلند باکتری ها را بوسیله ی یک میکروسکوپ مورد آزمایش و شناسایی قرار داد. اما بعید به نظر می رسد که آپرت از چنین نکته ای مطلع بوده است، چرا که وی دانشمند نبوده و گزارش کار هوک به زبان فرانسه در دسترس او قرار نگرفته بود. اولین کسی که به اهمیت و تاثیر میکروارگانیزم ها در مواد غذایی پی برد و در این زمینه تحقیق کرد، پاستور بود. او برای اولین بار در سال 1837 به ترش شدن شیر بوسیله ی میکروارگانیزم ها اشاره کرد و در حدود سال 1860 میلادی جهت از بین بردن میکروارگانیزم های موجود در شراب و آبجو از حرارت استفاده کرد، این عمل در حال حاضر مربوط به پاستوریزاسیون است.
ویژگی های درونی و عوامل خارجی ترکیبات غذایی موثر بر فعالیت میکروارگانیزم هاممکن است روی یک ماده غذایی میکروارگانیزم های مختلفی باشد و وقتی وجود آن بررسی شود، عوامل موثری از ماده ی غذایی مشاهده می شود. هر میکروارگانیزم شرایط خاصی برای حیات خود دارد که در چهارچوب عوامل خارجی و داخلی ماده ی غذایی بررسی می شود. در مواد غذایی اکثر میکروارگانیزم ها فساد و تخریب و مسمومیت به بار می آورند. عوامل درونی شرایط ذاتی و عوامل خارجی شرایط محیطی رشد هستند.
با فاصله گرفتن از عوامل درونی و بیرونی موثر بر میکروارگانیزم می توان آن را به خوبی کنترل کرد.
عوامل درونی:
1. PH: هرماده غذایی PH خاص خود را دارد.
2. رطوبت: از اساسی ترین و ضروری ترین نیاز های یک میکروارگانیزم است به گونه ای که در صورت نبودن رطوبت رشد میکروارگانیزم ها مختل می شود. (در عمل فریز کردن مواد غذایی می توان مشاهده کرد که رشد میکروارگانیزم ها متوقف شده است که این مسئله حاکی از نبود رطوبت است.)
3. پتانسیل اکسیداسیون – احیا (Eh): مربوط به وجود اکسیژن و نیاز اکسیژنی باکتری ها می باشد.
4. ترکیبات مغذی: برای هر ماده ای متفاوت است و تاثیر مهمی بر رشد میکروارگانیزم ها دارد و در صورت وجود بیشتری از این نوع ترکیبات، میکروارگانیزم می تواند توان خود را در شرایط نامساعد Eh، PH، اکسیژنی تحمل کند.
5. ساختار بیولوژیک مواد غذایی (شرایط فیزیولوژیک): مانند بخش پوست و یا سطح مواد غذایی.
6. ترکیبات ضد میکروبی: مانند آلیسین در سیر، تیمور و لیزوزین در پوست تخم مرغ (به دلیل وجود این ترکیب بر روی پوست تخم مرغ باید از شستشوی سطح تخم مرغ خودداری کرد.
عوامل خارجی:
1. رطوبت نسبی در اطراف ماده ی غذایی
2. درجه حرارت نگهداری
3. حضور و غلظت گاز های اتمسفر (در انبار ها و مراکز نگهداری مواد غذایی می توان به کمک گاز های اکسیژن و N2 شرایط گاز های محیط را کنترل کرد.)
4. حضور سایر میکروارگانیزم ها