روش های کشت باکتری

آزمایش: روش های کشت باکتری

هدف: تفهیم روش ها، مراحل کشت باکتری و بررسی رشد آن ها

به نام آفریننده ی آفرینش

مقدمه:

محیط کشت:

از آن جا که میکروب یک موجود تک سلولی بوده و قادر است کلیه اعمال حیاتی خود را مستقلا انجام دهد بدون آن که نیاز به سلول دیگری داشته باشد. این اصل بیانگر آن است که میکروب ها هم احتیاج به غذا و آب و مواد آلی و معدنی دارند. محیطی مغذی که حاوی کلیه احتیاجات یک میکروب اعم از مواد غذایی و عناصر و غیره باشد که موجب رشد آن میکروب شود را اصطلاحا محیط کشت می گویند.

این محیط کشت می تواند به صورت دست ساز بوده یا به طور طبیعی یعنی داخل سلول های بدن یک جانور باشد.

میکروب ها را می توان بر روی محیط ها و در ظروف مختلف کشت داد که انتخاب شکل بستگی به نوع کشت دارد. مثلا در کشت هایی که محیط آن مایع است ظروف کشت لوله ای می باشد و محیط های جامد (آگاردار) هم در پلیت و هم در لوله کشت داده می شوند.

کشت سطحی :

در این نوع کشت هم از محیط پیش ریخته استفاده می شود. این روش کشت بیشتر برای محیط های مایع میکروبی کاربرد دارد و یا اگر محیط مایعی مانند شیر مشکوک به آلودگی میکروبی باشد آن را می توان به این روش کشت میکروبی داده و میکروارگانیزم های موجود در آن را مشخص نمود.

برای این کار ابتدا یک رقت معینی از محیط مایع تهیه نمایید. سپس با استفاده از پیپت استریل مقدار مشخصی از آن رقت را برداشته و در سطح محیط جامد پیش ریخته توسط میله پخش کننده یا توک آنس پخش نمایید و بعد از انکوباسیون می توانید کلونی های رشد یافته در سطح محیط کشت را مشاهده کنید توجه داشته باشید که هنگام انجام کشت سطحی باید سطح محیط خشک باشد .

چون هنگام ریختن محیط کشت به صورت پیش ریخته ممکن است بخار آب روی درب پلیت و سطح محیط جمع شود و برای خشک کردن آن می توان محیط ها را در یک گرم خانه با دمای 50-25 درجه قرار داده و خشک نمود. به این ترتیب که درب پلیت را برداشته و قسمت محتوی محیط کشت را وارونه روی لبه درب قرار دهید تا قطرات رطوبت حذف گردد.

هم چنین می توانید پس از ریختن محیط کشت در پلیت در صورت تجمع حباب هوا ، آن ها را با شعله دادن سطح محیط حذف نمایید. این کار باعث سترون شدن سطح محیط کشت هم می شود.

کشت آمیخته یا پورپلیت:

در این روش کشت هم نیاز به تهیه سوسپانسیون از باکتری می باشد. یعنی باید از باکتری مورد نظر در محیط مایع رقت معینی را تهیه نموده بعد به میزان 1 سی سی از آن را در کف پلیت استریل ریخته سپس از محیط کشت مورد نظر که قبلا استریل شده و حرارت آن به حدود 45 درجه سانتیگراد رسیده به میزان 15-20 سی سی به پلیت اضافه نمایید. سپس با حرکات دورانی بصورت عدد 8 انگلیسی آن را کاملا مخلوط کنید. اگر نیاز بود مجددا سطح محیط آمیخته با باکتری را با یک لایه نازکی از همان محیط کشت بپوشانید، دراین حالت به آن کشت دولایه هم گفته می شود.

گزارش:

در بررسی انواع روش های کشت در هفته ی گذشته به بررسی روش های کشت در محیط کشت مایع و برای جامد کشت عمقی، خطی و سطح شیبدار را انجام داده ایم و حال در این هفته به بررسی روش های کشت سطحی و پورپلیت می پردازیم.

ابتدا عمل رقیق سازی را بر روی نمونه ی مورد آزمایش (نوشابه) انجام می دهیم و تا رقت 10^-3 را تهیه می کنیم. سپس برای کشت سطحی یک پلیت محیط کشت پیش ساخته (EMB) را برداشته و از رقت 10^-3 تهیه شده، با استفاده از پیپت یک میلی لیتر روی محیط کشت حاضر می ریزیم و با استفاده از میله شیشه ای سر کج آن را پخش می کنیم و در انکوباتور قرار می دهیم.

برای کشت پور پلیت نیز ابتدا یک تا دو میلی لیتر از رقت تهیه شده ی 10^-3 را با استفاده از پیپت در کف پلیت استریل می ریزیم و سپس به صورت چشمی 20 تا 25 میلی لیتر محیط کشت (PCA) را به آن اضافه می کنیم و در مرحله ی بعد به صورت عدد 8 انگلیسی دوران می دهیم و می گذاریم تا محیط کشت ببندد و در انکوباتور قرار می دهیم.

·     در انجام آماده سازی محیط کشت و رقیق سازی موارد اصولی فراموش نشود.

·     در انجام آزمایشات بر روی محیط کشت جامد سعی شود تا زمان کار بر روی محیط کشت به محیط آسیبی نرسد.

·     شرایط انکوباتور برای کشت زمان 72 ساعت و دمای 37 درجه ی سانتی گراد می باشد.

·     توجه داشته باشید که این آزمایش را نیز مانند تمام آزمایشات در شرایط استریل و در کنار شعله انجام می شود.

نتیجه:

کشت سطحی: یک کلونی بزرگ به شکل نامنظم و دارای سطح برآمده در نمونه دیده می شود.

کشت پورپلیت: حداکثر30 کلونی به شکل کروی و دارای شکلی منظم در محیط کشت رشد یافته اند.

خطای آزمایش:

در کشت سطحی به دلیل برگرداندن سریع محیط کشت پس از ریختن رقت مقداری از آن خارج شده و دلیل رشد نیافتن درست کلونی ها بر روی محیط کشت نیز همین می باشد و هم چنین در کشت پورپلیت به دلیل ریختن رقتی بیش از حد مایع معلق در محیط کشت دیده می شود.

استفاده از لوازم استریل نیافته نیز عاملی بر کشت نادرست باکتری ها می باشد.

منبع:

 www.azmayeshat.mihanblog.com   

اهالی خانه حاجی 3

اهالی خانه حاجی 2

جلسه هفتم****4/2/90

روش شمارش باکتری و انواع باکتری و مراحل رشد باکتری

روش شمارش بیشترین تعداد احتمالی: این روش یکی از بهترین روش هاست و یکی از روش های کاربردی در صنایع غذایی حساس مثل لبنیات (شیر) می باشد و معمولا برای شمارش میکروارگانیزم هایی که تعدادشان کم تر از 10cfu باشد، استفاده می شود و این روش بر اساس میکروارگانیزم هایی که به صورت یکنواخت پراکنش دارند می باشد. (پراکنش برای اندازه گیری مهم است) در این روش تعداد مراحل نمونه گیری تکرار می شود. مثال:

سه مرحله نمونه گیری با رقت های مختلف: 10⁴ و 10⁵ و 10⁶ که با استفاده از لگاریتم عدد نهایی حاصل می شود. و خطا نیز از طریق انحراف معیار محاسبه می شود.

در صورت کم بودن تعداد میروارگانیزم ها از دو روش برای شمارش استفاده می شود:

1- روش مستقیم    2- روش غیر مستقیم

روش مستقیم: استفاده از میکروسکوپ

روش غیر مستقیم: استفاده از عوامل ایجاد شده

1- کدورت: رشد میکروارگانیزم ها همراه با کدر شدن ماده ی غذایی است.

2- تولید گاز: از حباب های گازی تشکیل شده استفاده می شود.

3- تولید اسید و باز (تغییر PH): همراه با تغییر رنگ باکتری است.

4- ترکیبات احیایی: ترکیبات رنگی (متیلن بلو، روزازورین، فنیل ترازولیوم کلراید) که به دلیل تمایل زیاد   باکتری ها به جذب الکترون که تغییر رنگ را شامل می شود.

انواع باکتری از لحاظ نیاز به اکسیژن:

1- هوازی اجباری: بر روی سطح ماده موجود در ظرف

2- بی هوازی اجباری: در انتهای ماده موجود در ظرف 

3- بی هوازی اختیاری: در تمام نقاط ماده موجود در ظرف

4- میکرو آئروفیل: در زیر سطح ماده موجود در ظرف

انواع باکتری از لحاظ دمایی:

نوع باکتری	دمای رشد (درجه سانتی گراد)	اکتیمم (دمای بهینه رشد) (درجه سانتی گراد)
سرما دوست	20-0	12-7
سرما گرا	30-0	17-10
مزوفیل	45-20	37-25
ترموفیل	75-45	50
هایپر ترموفیل	بیش از 100	-

ترمودیوریک: این دسته از باکتری ها در دمای بالا فقط زنده می مانند و قادر به رشد و تکثیر نیستند.

هالوفیل (نمک دوست): در مقدار بالای نمک، رشد و تکثیر و زندگی می کنند.

هالو دیوریک: در مقدار بالای نمک فقط زنده می مانند و قادر به رشد نیستند.

اسموفیل (قند دوست): در مقدار بالای قند، رشد و تکثیر و زندگی می کنند.

اسمو دیوریک: در مقدار بالای قند فقط زنده می مانند و قادر به رشد نیستند.

مراحل رشد باکتری:

a: مرحله فاز تاخیری (lag phase): در این مرحله هیچ گونه رشدی وجود ندارد، از چند ساعت تا چندین ساعت به طول می انجامد، از دلایل طولانی شدن این فاز، تعداد کم باکتری ها و عدم سازگاری با محیط کشت و استفاده از محیط های کشت قدیمی و نامساعد بودن شرایط می باشد و هر چه شرایط مساعدتر باشد، زمان این فاز کاهش می یابد. در این مرحله یک سری واکنش های بیو شیمیایی اتفاق می افتد که نتیجه ی آن، افزایش سازگاری با محیط کشت می باشد و هم چنین اگر هر چه میکروارگانیزم ها در مرحله ی b به محیط کشت جدید، منتقل شوند، فاقد فاز تاخیری خواهند بود.

b: مرحله فاز رشد انفجاری (accelerating phase): این مرحله به دنبال فاز تاخیری است. در این مرحله باکتری خود را به شرایط جدید سازش (سازگاری:adaptation) و شروع به رشد سریع در محیط کشت می کند.

c: فاز رشد لگاریتمی (log phase): یکی از مهم ترین مراحل رشد می باشد، در این مرحله تعداد باکتری ها در واحد زمان دو برابر می شود و به سرعت جمعیت باکتری ها افزایش می یابد و بیشترین میزان تولید   متابولیت ها (آنزیم ها، آنتی بیوتیک ها) در این مرحله می باشد و همواره صنایع تولیدی فراورده های باکتریایی به دنبال این فاز می باشند.

d: مرحله ی سکون (stationary phase): بعد از نامساعد شدن شرایط، کم شدن مواد مغذی، به هم خوردن تعادل PH، ترشح متابولیت های سمی، فاز رشد لگاریتمی به مرحله ی سکون می رسد که در این مرحله تعداد باکتری های مرده و متولد شده، برابر است. هرچه مقدار پروتیین در باکتری ها، سریع تر کاهش یابد، باکتری   زود تر به مرحله ی سکون می رسد و باکتری هایی که دارای رشد سریعتری هستند، نسبت به آنزیم ها و مواد شیمیایی حساس ترند (باکتری ها در مرحله فاز رشد نمایی نسبت به فاز تاخیری حساسیت بیشتری دارند).

e: مرحله ی مرگ (death phase): در این مرحله آهنگ رشد کم شده و هیچ وقت به صفر نمی رسد (مثل باکتری vibrio که در این مرحله یک سال و باکتری سودزموناس که 14 سال زنده می مانند). در این مرحله باکتری های مولد اسپور قادر به تولید اسپور هستند و باکتری هایی که قادر به تولید اسپور نیستند به صورت کامل از بین نمی روند.

جلسه ششم****28/1/90

اندازه گیری اندازه ی یک باکتری برای بررسی رشد آن و شمارش باکتری

اندازه گیری اندازه ی یک باکتری برای بررسی رشد آن:

روش اول: ابتدا باکتری را بر روی لام آزمایشگاهی قرار داده و با استفاده از میکروسکوپ سیاه از آن عکس تهیه کرده و با بزرگنمایی حجم آن را بدست می آوریم.

روش بیومس (زی توده-biomass): استفاده از کل توده ی زیستی که برای اندازه گیری اقدام به استفاده از تعیین میزان کربن می کنیم.

روش تعیین میزان ماده ی خشک: با بررسی ترکیبات شیمیایی (proximate compozitoin) موجود از قبیل: خاکستر (ash)، پروتیین (protein)، چربی (fat)، رطوبت (moisture).

در این روش خاکستر از بقایای مواد معدنی است و هم چنین در رطوبت پس از خشک کردن، ماده ی خشک باقی می ماند که اگر این مقدار متغیر باشد در میزان رشد باکتری نیز تغییر ایجاد می کند. (مطابق با تغییر)

*با حذف رطوبت پروتیین اضافه می شود.

روش تعیین از طریق افزایش حجم: با افزایش حجم، DNA ثابت است و سیتوپلاسم افزایش یافته و در نتیجه RNA نیز افزایش می یابد و هم چنین با افزایش تعداد و رشد، هم DNA و هم RNA افزایش می یابند که در این روش از طریق سنجش میزان RNA نسبت به DNA، رشد را تعیین می کنند.

*اگر مقدار RNA بیش از حجم مجاز شود، برای انسان آلرژیک می شود.

شمارش باکتری:

شمارش باکتری از دو طریق انجام می پذیرد: شمارش باکتری های زنده- شمارش باکتری های زنده و مرده

شمارش باکتری های زنده:

روش شمارش صفحه ای: (pour plate count): از دقیق ترین و استاندارد ترین روش ها می باشد که در تعیین کیفیت بهداشتی مواد غذایی استفاده می شود. این روش مشکلاتی نیز به همراه دارد که عبارتند از: عدم توانایی در سنجش میکروارگانیزم های سرما دوست و سرما گرا و هم چنین عدم توانایی در سنجش میکروارگانیزم های غذاهای تخمیری.

در این روش ابتدا رقت های خاصی تعیین می شود (با توجه به دید اولیه ای که نسبت به باکتری های مواد غذایی وجود دارد و هم چنین در صورت عدم وجود دانش کافی علتی است بر این که چندین رقت تهیه شود)(مثلا در یک ماهی برای گوشت آن رقت های 10²-10⁷ تهیه می شود) بعد از تهیه رقت ها محیط کشت در داخل لوله های آزمایش یخته شده و در داخل آب جوش قرار می گیرد. در همین حال رقت های تعیین شده در پلیت قرار می گیرند و سپس محیط کشت از حرارت بالا خارج شده و تا دمای 40-45 درجه سانتی گراد سرد می شود. بعد از سرد شدن، محیط کشت به پلیت اضافه می شود و در انکوباتور به مدت 48 تا 72 ساعت قرار می گیرد و هم چنین دمای 32 تا 37 درجه سانتی گراد. (با این روش تنها باکتری های هوازی مزوفیل مورد بررسی قرار می گیرند) پس از ایجاد کلونی ها برای شمارش از لام هماسیتومتر (hemacytometer) استفاده می شود.

شمارش باکتری های زنده و مرده: این روش جهت شمارش باکتری های زنده و مرده صورت می گیرد و این عمل از طریق میکروسکوپ می باشد که پس از تهیه ی گسترش باکتریایی و عمل رنگ آمیزی، تعداد میکروب ها در زیر میکروسکوپ شمارش می شود.

روش کدورت سنجی: این روش جهت سنجش تعداد باکتری ها در محیط کشت مایع انجام می شود که در این روش سانتریفیوژ یا شستشوی قبل از انجام مراحل، لازم می باشد.

این روش خود به دو روش مجزا تقسیم می شود: 1- اسپکتروفتومتر   2- لوله های مک فارلند

1-      اسپکترومتر: این روش با استفاده از دستگاهی با همین نام انجام می شود که بر اساس بررسی اختلاف طول موج تابیده شده به ماده و طول موج خارج شده از سلول و مطابقت با یک نمونه محلول شاهد (blank) تعداد باکتری ها را تعیین می کند.

2-      لوله های مک فارلند (Mc farland): از نمک باریم برای ساختن لوله های مک فارلند استفاده می شود و پس از تهیه غلظت های مختلف این نمک، لوله هایی با کدورت های مختلف ایجاد می شود که با مقایسه ی     نمونه ی آزمایشگاهی و نمونه های استاندارد و بررسی جدول استاندارد موجود، تعداد باکتری ها مشخص می شود.

paint

روش های کشت باکتری

آزمایش: انواع کشت باکتری

هدف: تفهیم روش ها، مراحل کشت باکتری و بررسی رشد آن ها 

به نام خدای علم و اندیشه

مقدمه:

محیط کشت:

از آن جا که میکروب یک موجود تک سلولی بوده و قادر است کلیه اعمال حیاتی خود را مستقلا انجام دهد بدون آن که نیاز به سلول دیگری داشته باشد. این اصل بیانگر آن است که میکروب ها هم احتیاج به غذا و آب و مواد آلی و معدنی دارند. محیطی مغذی که حاوی کلیه احتیاجات یک میکروب اعم از مواد غذایی و عناصر و غیره باشد که موجب رشد آن میکروب شود را اصطلاحا محیط کشت می گویند.

این محیط کشت می تواند به صورت دست ساز بوده یا به طور طبیعی یعنی داخل سلول های بدن یک جانور باشد.

میکروب ها را می توان بر روی محیط ها و در ظروف مختلف کشت داد که انتخاب شکل بستگی به نوع کشت دارد. مثلا در کشت هایی که محیط آن مایع است ظروف کشت لوله ای می باشد و محیط های جامد (آگاردار) هم در پلیت و هم در لوله کشت داده می شوند.

انواع کشت باکتری:

1- کشت باکتری در محیط کشت مایع (Broth)

2- کشت باکتری در محیط کشت جامد (Agar)

روش کشت باکتری در محیط کشت مایع:

1- ابتدا یک آنس حلقوی برداشته و آن را در دست راست بگیرید. بعد آن را روی شعله کاملا سترون کنید و بگذارید تا سرد شود.

2- محیط حاوی باکتری (لوله یا پلیت) را در دست چپ بگیرید و درب آن را با دست راست در کنار شعله باز کنید. دقت کنید که درب محیط کشت را روی میز کار خود نگذارید.

3- اگر محیط کشت در لوله است دهانه آنرا چند با ر از روی شعله عبور دهید تا سترون شود همچنین درب لوله را بیش از حد باز نگه ندارید.

4- نوک آنس را وارد محیط کرده و یک لوپ از آنرا بردارید. منظور از لوپ سوزن کشت با نوک حلقه ای است .

5- دهانه لوله را مجددا با شعله سترون کرده و درب آن را بگذارید و محیط کشت را در جای خود قرار دهید.

6- لوله حاوی محیط کشت را در دست چپ بگیرید و نوک آنس آلوده به باکتری مورد نظر را داخل محیط فرو برده و به آرامی تکان دهید تا میکروب ها در محیط پخش شوند.

7- در مواردی که میکروب را از پلیت (محیط کشت جامد) بر می دارید با نوک آنس کمی از پرگنه را برداشته و با رعایت مواردی که گفته شد آن را داخل محیط مایع فرو برده و به آرامی هم بزنید تا همگن شود.

8- دهانه لوله حاوی محیط کشت جدید را با شعله سترون کرده و درب آن را بگذارید و آن را در داخل انکوباتور قرار دهید.

9- نوک آنس را مجددا با شعله استریل کرده و در جای خود قرار دهید.

روش کشت باکتری در محیط جامد:

محیط کشت جامد به دو صورت وجود دارد : 1- محیط کشت جامد در لوله 2- محیط کشت جامد در پلیت

در لوله به دوصورت عمودی ((Stab Culture و شیبدار (Slant Culture) دیده می شود که هر کدام از آن ها روش کشت خاص خود را دارند.

روش کشت عمقی در لوله:

در این حالت محیط کشت آگار دار (جامد) را با حفظ شرایط استریل در حالت مذاب داخل لوله های آزمایش استریل ریخته و به حالت عمودی آن را در یک جای ساکن قرار دهید تا سرد شود در این حالت با آنس نوک تیز استریل شده در کنار شعله از پرگنه باکتری مقداری را برداشته و آن را به صورت عمودی در مرکز این محیط تا انتها فرو برده و بدون هیچ گونه تغییر حالتی آن را از همان مسیر خارج کنید . بعد لوله را در انکوباتور قرار دهید . این روش کشت دارای خصوصیاتی می باشد و آن این است که هنگامی که نوک آنس را در محیط فرو می برید در ابتدای ورود آنس به محیط تراکم باکتری زیاد است و به ترتیب که به عمق محیط فرو می رود از تعداد باکتری ها کاسته می شود تا به انتهای لوله که می رسد تراکم باکتری به حداقل می رسد و از طرفی در انتهای محیط کشت لوله ای اکسیژن کمتر از قسمت سطحی آن است و باکتری ها به ترتیبی که با تراکم وارد محیط شده اند براساس نیاز با اکسیژن (هوازی یا بی هوازی بودن) در محیط رشد متفاوتی دارند. یعنی اگر باکتری هوازی باشد رشد آن در قسمت سطحی بیشتر است و اگر بی هوازی باشد رشد آن در قسمت عمقی بیشتر می شود.

روش کشت در سطح شیبدار در لوله:

در این حالت محیط کشت آگار دار استریل را در لوله های استریل شده ریخته و قبل از سرد شدن آن ها را به حالت شیبدار قرار می دهند تا سرد شوند. در این حالت با آنس سوزنی با حفظ شرایط استریل از پرگنه باکتری برداشته و در کنار شعله نوک آنس را ابتدا به صورت عمودی وارد قسمت عمودی محیط کشت کرده بعد به آرامی آن را از همان مسیر خارج کرده و بدون این که نوک آنس از محیط جدا شود آن را به حالت زیگزاگ روی سطح شیبدار بکشید.

این روش هم خصوصیات بسیار زیادی از جهت تشخیص سویه های باکتری دارد و اطلاعاتی در مورد هوازی یا بی هوازی بودن آن ها و هم چنین خصوصیات منحصر به فرد باکتری ها به ما می دهد. مثلا ممکن است در کشت یک نوع باکتری، رنگ قسمت عمودی محیط کشت تغییر کند که نشانگر بی هوازی یا بی هوازی اختیاری بودن باکتری است که بعدا در تست های اختصاصی دیگر را روی آن انجام می دهیم یا مثلا باکتری ها فقط در قسمت شیبدار رشد می کنند و رنگ آن قسمت تغییر می کند که پی به هوازی بودن آن می برید.

روش دیگر کشت روی این محیط از محیط مایع می باشد که یک لوپ از کشت مایع باکتریایی برداشته و در سطح شیبدار بصورت زیگراک می کشید و کشت می دهید.

روش کشت خطی:

در این روش از محیط پیش ریخته استفاده می شود. به این ترتیب که ابتدا به وسیله یک آنس حلقوی سترون شده مقداری از پرگنه باکتری را برداشته و آن را روی سطح محیط پیش ریخته به صورت خط های موازی و در چند جهت می کشید. در کشت های خطی برای بدست آوردن کلونی های تک می توانید پلیت را به 4 قسمت تقسیم کنید بعد در قسمت اول ابتدا نوک آنس را که محتوی پرگنه باکتری است را به صورت خط های موازی کشیده و بعد خطوط را در منطقه دوم از انتهای خط انتهایی منطقه اول در جهت دیگر ادامه می دهید و در منطقه سوم و چهارم هم به همین صورت عمل می کنید. خصوصیت این روش این است که وقتی خطوط موازی را روی سطح محیط می کشید به ترتیب از تراکم باکتریها کاسته می شود و به انتهای خط که می رسید تراکم باکتری کمتر است و در منطقه دیگر وقتی از انتهای خط منطقه قبلی استفاده می کنید در واقع تراکم بسیار کمتر از تراکم باکتریها در ابتدا می باشد و در نتیجه در مناطق دیگر هم به ترتیب از تعداد باکتری ها کاسته می شود تا جایی که در منطقه چهارم شما می توانید پرگنه های تکی داشته باشید که کلونی خالص نامیده می شود. بنابراین انجام درست کشت خطی منجر به ایجاد کلنی خالص می شود این کلونی تنها از یک باکتری مادری به وجود می آید (تعریف کلونی خالص). باکتری های منفرد را باکتری های مادر می نامند که این باکتری ها پس از کشت خطی و جدا شدن سلول های باکتری از یکدیگر به وجود می آیند.

توجه داشته باشید که کلونی خالص به کلونی گفته می شود که با کلونی دیگر تماس نداشته باشد.

در مورد محیط های کشت باکتریایی که به صورت مایع می باشند برای انجام کشت خطی روی محیط پیش ریخته فقط یک بار لوپ را داخل محیط محتوی باکتری کرده و یک لوپ از آن بردارید سپس آن را روی محیط پیش ریخته قرار داده و به صورت خطوط موازی آن را در چند جهت بکشید و یا مراحل فوق را روی آن انجام دهید.

از آن جا که مراحل کار انجام شده در آزمایشگاه، روش های اصولی و تعریف شده برای آزمایشات می باشد و این مراحل را نیز در آزمایشگاه طبق همان اصول انجام داده ایم، تکرار دوباره ی مباحث بیان شده در گزارش کار لزومی ندارد.

این گروه نیز کشت در محیط مایع، کشت در سطح شیبدار و کشت به روش خطی را در محیط پلیت کانت آگار انجام داده است.

<!--[if !supportLists]-->·     <!--[endif]-->در انجام آزمایشات بر روی محیط کشت جامد سعی شود تا زمان کار بر روی محیط کشت به محیط آسیبی نرسد.

<!--[if !supportLists]-->·     <!--[endif]-->دقت شود تا محیط کشت را به همراه کلونی از محیط کشت قبلی برداشت نکنیم.

<!--[if !supportLists]-->·     <!--[endif]-->شرایط لازم برای نمونه های آماده شده، مدت 48 ساعت و دمای 37 درجه سانتی گراد می باشد.

<!--[if !supportLists]-->·     <!--[endif]-->توجه داشته باشید که این آزمایش را نیز مانند تمام آزمایشات در شرایط استریل و در کنار شعله انجام می شود.

نتیجه:

محیط کشت مایع: در نتیجه این آزمایش می توان تعداد زیادی از انواع باکتری از قبیل هوازی، بی هوازی و آئروفیل را مشاهده کرد.

محیط کشت جامد:

کشت عمقی در سطح شیبدار: تعداد زیادی کلونی های رشد یافته را می توان دید که به رنگ کرم می باشند و هم چنین باکتری هایی به رنگ زرد پر رنگ نیز در سطح محیط وجود دارند.

کشت خطی: کلونی های رشد یافته را می توان مشاهده کرد و هم چنین در این نمونه یک کلونی خالص مشاهده می شود.

خطای آزمایش:

برداشت نادرست کلونی یا انجام روش نادرست کشت باکتری ها به وی‍ژه در روش خطی می تواند در نتیجه ی آزمایش اختلال ایجاد می کند.

منبع: www.azmayeshat.mihanblog.com        

شرایط لازم برای نمونه های آماده شده، مدت 48 ساعت و دمای 37 درجه سانتی گراد می باشد./p dir=

اهالی خانه حاجی

آماده سازی محیط کشت در ظروف و بررسی میکروارگانیزم های هوازی

آزمایشات: آماده سازی محیط کشت در ظروف و بررسی میکروارگانیزم های هوازی

اهداف: فراهم سازی محیط کشت باکتری ها و هم چنین بررسی وضعیت میکروارگانیزم های موجود در هوا

به نام سرآغاز علم

مقدمه:

تعداد میکرو ارگانیسم های موجود در هوا در مقایسه با خاک و آب بسیار کم بوده و معمولا از نظر متابولیسمی فعال نیستند. در واقع هوا، محیط زیست میکروارگانیسم ها نیست، بلکه تنها محیط و وسیله انتقال فعال میکروبها می ‌باشد.

ژوزف لیستر اولین کسی بود که به اهمیت میکروارگانیزم های موجود در هوا پی برد و بررسی میکروارگانیزم های هوای اطراف نشان می دهد که پس از رها شدن در هوا، بالاخره به لایه سطحی هوا در سطح زمین یا گیاهان باز می گردند و ذخیره می شوند. ذخیره شدن میکروارگانیسم ها در هوای خشک و در باران، به روش های مختلف انجام می شود. مثلا ذخیره شدن در هوای خشک از طریق نشست اسپور ها در اثر نیروی جاذبه در سرعت حرکت کم باد انجام می شود و در این شرایط حائز اهمیت است. هم چنین در ذخیره سازی در باران، قطرات باران می توانند ذرات میکروبی را در خود گرفته و آن ها را به طرف زمین حمل کنند.

انواع و تراکم میکروارگانیسم ها در محیط های باز شهری و خارج از شهر و نیز بر حسب تراکم جمعیت، پوشش گیاهی و فعالیت های انسانی متفاوت است. به طور کلی در محیط های شهری، تعداد باکتری ها بیشتر بوده در حالی که در هوای مناطق روستایی، تعداد باکتری ها از چند صد عدد در هر متر مکعب تجاوز نمی کند .

متداول ترین قارچ های هوا دوترومیست ها، کلادوسپوریوم، بازیدیومیست ها، اسپوروبلومیس است و فراوانترین آنها بازیدیومیست ها هستند .

به طور کلی تراکم میکروارگانیسم ها به ویژه اسپورهای قارچی در هوا بر حسب فصل سال، شرایط آب و هوایی، تغییرات درجه حرارت و رطوبت، میزان بارندگی و جریان هوا متفاوت است. آلودگی هوا با گوگرد منجر به افزایش تعداد میکروبها می شود اما در مقابل وجود ترکیبات و فلزات سنگین در هوا، از جمله گرد و غبار صنایع فلز کاری، در مقیاس کوچک و احتمالا سرب حاصل از دود اتومبیل منجر به کاهش تعداد میکروبها می شود.

گزارش:

1) آماده سازی محیط کشت در ظروف: (نمونه ی جامد (agar)) آماده سازی محیط کشت در پلیت و هم چنین لوله های آزمایش انجام می شود.

الف) آماده سازی در پلیت:

ابتدا مقداری از نمونه را برداشته (25-20 میلی لیتر) و مقداری از درب پلیت را به آرامی باز می کنیم (نیم باز کرده) و مقدار تعیین شده را در پلیت می ریزیم و سپس بر روی میز آزمایش قرار داده و به شکل عدد هشت انگلیسی دوران می دهیم. قابل توجه است که در هنگام دوران نمونه ی موجود در پلیت نباید با درب پلیت برخورد کند. عمل دوران را جند بار انجام داده تا محیط کشت در تمام سطح پلیت به طور یکنواخت پخش شود و محیط کشت پس از آماده سازی باید برعکس قرار بگیرد، زیرا پس از ریختن محیط کشت و بستن درب پلیت به علت دمای بالای محیط کشت، بخار هایی ایجاد شده و اگر به همان شکل، مستقیم پلیت را قرار دهیم، پس از طی زمان اندکی بخارات به محیط کشت برگشت می کند و موجب تخریب محیط کشت می شوند.

ب) آماده سازی در لوله های آزمایش:

نمونه های محیط کشت در لوله های آزمایش به دو صورت عمودی (stab culture) و شیب دار (stant culture) قرار می گیرند و نمونه های آزمایشگاهی نیز با ریختن نمونه به لوله ی آزمایش آماده می شوند. تنها باید در نحوه ی قرار دادن لوله ی آزمایش پس از ریختن نمونه دقت کرد تا با توجه به خواسته ی ما از سطح نمونه ی موجود، لوله ی آزمایش را عمودی و یا شیب دار در مکانی ثابت قرار دهیم تا محیط کشت شکل بگیرد. پس از ریختن نمونه در لوله ی آزمایش سر آن را باید با پنبه ی استریل و فویل آلومینیومی ببندیم تا مانع از ورود باکتری ها به محیط کشت شویم.

2) بررسی میکروارگانیزم های موجود در هوا:

پس از آماده سازی محیط های کشت در پلیت ها، 6 پلیت برداشته و به ترتیب به صورت زیر آماده سازی می شود:

A') نمونه ی شاهد: محیط کشت به همان شکل و بدون هیچ گونه عملی دست نخورده باقی می ماند.

B') هوای آزاد: محیط کشت پس از ریخته شدن در پلیت و برداشتن درب پلیت مستقیما در مجاورت هوا به مدت 15 تا 20 دقیقه قرار می گیرد.

C) (گروه A) دست کثیف: باید انگشت یا قسمتی از دست را آرام بر روی محیط کشت کشید، بدون این که به محیط کشت آسیبی برسد.

D) (گروه B) دست تمیز: قبل از آزمایش دست را باید تمیز شست و سپس مطابق نمونه C عمل کرد.

E) (گروه C) سرفه کردن: همان طور که مشخص است چند بار بر روی محیط کشت عمل سرفه کردن را انجام می دهیم.

F) (گروه D) لباس: به کمک آنس (باید توجه کرد که آنس را قبل از آزمایش استریل کرد که این عمل با قرار دادن سر آن در مرکز شعله و به زاویه ی 45 درجه انجام می گیرد و برای خنک کردن آن نیز سر آن را در گوشه ای از محیط کشت نگه داشته تا دمای آن کاهش یابد) ابتدا سر آن را بر قسمتی از لباس می کشیم و سپس به صورت زیگزاگ بر روی نمونه ی محیط کشت می کشیم.

پس از انجام عملیات بالا، نمونه ها را به مدت 24 ساهت و در دمای 37 درجه سانتیگراد در انکوباتور می گذاریم (به صورت وارونه). پس از گذشت زمان تعیین شده نمونه ها را برداشته و با کمک نمونه های A' و B' موارد زیر را تعیین می کنیم.


نمونه
تعداد کلونی
رنگ
حالت

A
0
-
-

B
بیش از نیمی از پلیت
کرم
لزج

C
بیش از 80
کرم
کروی

D
بیش از 30
کرم
کروی و لزج

E
بیش از 100
کرم روشن
لزج

F
1
کرم
کروی




· باکتری ها در حالت لزج تا حدودی با مشکل شمارش مواجهند.

· انکوباتور دستگاهی است که پلیت های محیط کشت در آن قرار می گیرند و تامین کننده دمای مورد نیاز میکروارگانیزم ها برای رشد می باشد.

· قابل توجه است که مانند تمام آزمایشات میکروبیولوژی این آزمایش نیز باید در شرایطی استریل و در کنار شعله انجام شود.

نتیجه: آزمایشات میکروبیولوژی هر کدام دارای مراحل خاصی است که برای رسیدن به هدف مورد نظر باید درست انجام شوند و آماده سازی محیط کشت نیز از اهمیت بالایی برخوردار است و میکروارگانیزم های موجود در هوا در هر سطحی دارای وضعیت های گوناگونی می باشند و کشت درست و دقیق آن ها نیز در بررسی های میکروبی نقش مهمی دارد.

خطای آزمایش: خطای آزمایشات را می توان در شمارش نا درست کلونی ها و در حالت کلی بررسی اشتباه میکروارگانیزم ها اعلام کرد و هم چنین انجام نا درست مراحل فراهم آوری محیط کشت که هر کدام به نوبه ی خود می توانند در آزمایش اختلال ایجاد کنند.




منبع www.lenjan.ir

www.biolougy120.blogfa.com

www.daneshnameh.roshd.ir

آماده سازی محیط کشت

آزمایش: آماده سازی محیط کشت

هدف: فراهم آوری محیط کشت باکتری ها برای آزمایشات

به نام خدایی که کائنات را برای انسان معما ساخت

مقدمه:

روش تهیه محیط های کشت :

مطابق دستور کارخانه سازنده و با توجه به بروشور الصاقی روی آن می توان مقدار لازم از محیط کشت که به صورت پودری یا پلیت شده می باشد را برداشته و با مقدار توصیه شده آب مقطر در داخل ارلن مخلوط کنید بعد آن را با توجه به دستور کارخانه اگر لازم بود روی شعله قرار داده تا بر اثر حرارت شفاف شود که البته در بعضی از محیط ها نیازی به این کار نیست. بعد آن را در اتوکلاو قرار داده و به مدت 15 دقیقه در دمای 121 درجه سانتیگراد قرار می دهید تا استریل شود. بعضی از محیط های کشت که به دمای بالا حساس می باشند در اتوکلاو قرار نمی گیرند و این مسئله را کارخانه سازنده حتما متذکر شده است. بعد از اتوکلاو گذاری محیط های کشت آگار دار داخل ارلن سفت می شود و برای استفاده از آن ها باید دوباره حرارت داده شوند ولی محیط های کشت مایع به شکل مایع باقی می مانند و آماده مصرف هستند.


گزارش کار: آماده سازی محیط کشت (پلیت کانت آگار (plate count agar (pca)))

به طور معمول آماده سازی از طریق اطلاعاتی که بر روی ظرف و بسته بندی محیط های کشت درج شده است استفاده می شود. ابتدا مقدار تعیین شده محیط کشت را با ترازو اندازه گیری کرده و در یک ارلن با مقدار یک لیتر آب مقطر ترکیب می نماییم. (بری محیط کشت pca مقدار 23.5 گرم در حجم یک لیتر آب مقطر در نظر گرفته شده است که این عمل را در آزمایشگاه با مقدار 5.8 گرم pca و 250 میلی لیتر آب مقطر در ارلنی با حجم 250 میلی لیتر ترکیب می کنیم(. عمل ترکیب سازی توسط یک همزن شیشه ای انجام می شود و تا آن جایی پیش می رود که ترکیب موجود در ارلن کاملا یکنواخت گردد و برای بهتر حل شدن نیز می توان ارلن را در بن ماری (حمام آب گرم) قرار داد. توجه داشته باشید که در زمان تقابل نمونه ی موجود در ارلن و حرارت، باید نمونه مرتب هم زده شود. سپس ارلن را پس از ترکیب سازی نمونه موجود را برداشته و بوسیله ی تکه ای فویل آلومینیومی و پنبهی استریل سر ارلن را میبندیم و در اتوکلاو استریل می نماییم. شرایط اتوکلاو نیز برای استریلیزاسیون باید مطابق با شرایط زیر باشد:

دما: 121 درجه سانتیگراد / زمان: 15 دقیقه / فشار: 1.2atm، 1.2bar، 15pb/inch2

· تنظیم فشار در دستگاه اتوکلاو به طور خودکار زمانی که شرایط دیگر مساعد و درست باشد، تنظیم می گردد.

در محیط کشت مایع (broth)، مراحل اولیه مطابق شرایط بالا طی شده و در زمان هم زدن ابتدا در لوله های آزمایش به نسبت های مساوی ریخته شده و سپس در بن ماری برای ترکیب سازی قرار می گیرد. لوله های آزمایش سرشان با استفاده از پنبه و فویل آلومینیومی بسته شده و در اتوکلاو با توجه به شرایط مناسب کشت استریل می شود.

پس از عمل استریلیزاسیون، نمونه ی موجود در اتوکلاو (نمونه کاملا شفاف می شود) در پلیت ریخته شده و باکتری ها را روی آن کشت می دهیم. محیط های کشت مایع نیز به همین صورت از طریق لوله های آزمایش به پلیت منتقل می شود.



روش کار دستگاه اتوکلاو:

دستگاه اتوکلاو، دستگاه حرارت مرطوب (بخار آب) می باشد و دارای یک مخزن داخلی می باشد که در این مخزن سه پایه بر روی جداره ی آن تعبیه شده و دیگی آلومینیومی بر روی آن ها و دستگاه اتوکلاو قرار می گیرد. که در این دیگ نمونه ی آزمایش جای داده می شود. در مخزن زیرین آب قرار می گیرد تا با استفاده از حرارت دادن و بخار آب شرایطی مناسب برای استریل اتفاق بیافتد. قابل توجه است که آب موجود در اتوکلاو باید در سطحی زیر سه پایه ی موجود باشد. سپس با قرار دادن نمونه در دیگ آلومینیومی و قرار دادن دیگ بر روی پایه ها، درب اتوکلاو را بسته و پیچ های آن را محکم می کنیم و سپس از طریق قسمت تنظیمات شرایط را برای استریل تنظیم می کنیم.

تنظیم کردن اتوکلاو: پس از روشن کردن دستگاه، ابتدا دکمه ی mode را فشار داده و سپس از طریق دکمه های جهت بالا و پایین دما را تنظیم می کنیم و دکمه ی save را می زینم حال زمان را تنظیم می کرده و دوباره دکمه ی save را می زنیم و سپس دکمه ی mode و دستگاه شروع به کار می کند.

پس از شروع کار چراغ heather (قرمز رنگ) روشن و چراغ wk (آبی رنگ) که نشان دهنده ی میزان مناسب آب (water ok) نیز روشن می شود. پس از رسیدن دستگاه به حد مناسب، چراغ streal (زرد رنگ) روشن می شود و زمان تعیین شده به کار می افتد و زمانی که به صفر می رسد، دکمه end (سبز رنگ) روشن می شود.

بر روی درب دستگاه اتوکلاو، یک خروجی تخلیه ی بخار وجود دارد که بعد از عمل استریل آرام آرام آن را باز کرده تا فشار موجود در دستگاه خارج شود (نشان گر فشار بخار دستگاه بر روی درب آن قرار دارد) و به صفر برسد، پس از به صفر رسیدن صبر می کنیم تا زمانی که دما به 95 درجه سانتی گراد برسد و حال می توان درب را باز کرده و نمونه را بیرون بیاوریم و از آن استفاده کنیم.(صبرلازم برای خارج کردن نمونه جهت پیش گیری از سوختن و کاهش دمای زیاد نمونه می باشد)

نتیجه:

یادگیری روند آماده سازی محیط کش از ملزومات آزمایشات میکروبی که در این سطح انجام می شود، می باشد و مرحله ای مهم در کشت و پرورش میکروب ها می باشد.

خطای آزمایش:

اندازه گیری نا مناسب میزان تعیین شده ی مواد و هم چنین تنظیم نا صحیح دستگاه اتوکلاو و ترکیب نا صحیح نمونه موجب اختلال در روند آماده سازی محیط کشت می شود.

· توجه کنید که این آزمایش نیز مانند تمام آزمایشات میکربیولوژی باید در شرایط استریل انجام شود.

منبع: www.azmayeshat.mihanblog.com