اهالی خانه حاجی ۵

اهالی خانه حاجی ۴

img src=

جلسه دهم****25/2/90

تاثیر برخی از گازها بر روی میکروارگانیزم ها: در صنایع غذایی بر اساس تاثیر برخی گازها بر روی میکروارگانیزم ها انواعی از بسته بندی به وجود آمده است، از جهت افزایش ماندگاری مواد غذایی که یکی از این روش های بسته بندی که از اهمیت بالایی نیز برخوردار است روش بسته بندی در اتمسفر اصلاح شده  (modifying  atmo. packaging (MAP)) می باشد.

سیستم MAP: در این سیستم گازهای حاوی نیتروژن و دی اکسید کربن و اکسیژن تحت فشار به داخل بسته بندی منتقل می شوند. این سیستم برای بسته بندی گوشت قرمز بسیار مناسب است زیرا به دلیل حضور مقدار زیادی اکسیژن رنگ قرمز گوشت حفظ می شود. دونوع سیستم MAP وجود دارد:

1.  در سیستم اول نسبت گازهای اکسیژن، دی اکسید کربن و نیتروژن به ترتیب تا 70% ، 30-20%  و 20-0% می باشد و تحت این شرایط رشد میکروارگانیزم ها کاهش و بدون توقف است.

2.  در سیستم دوم غلظت اکسیژن بسیار پایین است و تا 10% می باشد و غلظت دی اکسید کربن و نیتروژن نیز افزایش می یابد.

تاثیر دی اکسید کربن بر میکروارگانیزم ها:

·     تاثیر گاز CO­₂ در دمای پایین تر افزایش می یابد. در تحقیقات انجام شده مشخص شده است که در غلظت    30-20% بیشترین تاثیر را بر میکروارگانیزم ها می گذارد.

·     با کاهش PH تاثیر CO­₂ بر میکروارگانیزم ها افزایش می یابد. این نوع بسته بندی بیشتر برای فراورده های گوشتی استفاده می شود تا فراورده های دریایی، زیرا PH گوشت آبزیان تقریبا در حد خنثی است اما PH گوشت قرمز می تواند اسیدی شود.

·     باکتری های گرم منفی نسبت به باکتری های گرم مثبت حساس ترند و در طی نگهداری یک فراورده در سیستم MAP، فلور (جمعیت) غالب گرم منفی، تبدیل به فلور غالب گرم مثبت می شوند.

·     در اثر کاربرد CO­₂، فاز رشد تاخیری و لگاریتمی طولانی تر شده و به تعویق می افتد.

·     هر چه فشار بسته بندی و تزریق گاز بیشتر شود، تاثیر بیشتری گاز CO­₂ بر میکروارگانیزم ها می گذارد.

دو نظریه در تاثیر CO­₂ بر ممانعت از فعالیت میکروارگانیزم ها وجود دارد که عبارتند از:

1.  CO­₂ قادر به متوقف کردن متابولیسم و تحریک واکنش دکربوکسیلاسیون (حذف گروه های کربوکسیلی)      می باشد.

2.  قادر به افزایش نفوذ پذیری غشای سیتوپلاسمی اند. مشخص شده است که CO­₂ قادر به نفوذ به غشای فسفولیپیدی دو لایه ی سیتوپلاسمی و تجمع در این قسمت و افزایش سیالیت و تغییر در نفوذ پذیری و خارج کردن باکتری ها از فعالیت نرمال و طبیعی خود است.

استفاده از مواد شیمیایی:

بسیاری از مواد شیمیایی بر اساس نوع بنیان (ساختار) شیمیایی و ویژگی های شیمیایی خود قادر به از بین بردن و یا متوقف کردن فعالیت بسیاری از میکروارگانیزم ها هستند.

ترکیب آلکیل دار (Alkilating): دارای خواص اکسایشی می باشد و ترکیبات دارای آلکیل قادرند در مولکول ها جایگزین ترکیباتی به اسم نوکلئوفیل (ترکیبات دهنده ی الکترون (ترکیبات احیا کننده) که برای حفظ عملکرد ساختار پروتیین و DNA مهم هستند) شده و پس از آن فعالیت باکتری را متوقف می شود.

ترکیبات اکسید کننده (oxidazing agents): در صورت بالا بودن غلظت، تاثیر بسیار مناسبی بر توقف باکتری دارند. از مهم ترین این مواد می توان به آب اکسیژنه (H₂O₂)، پرمنگنات پتاسیم (KMnO­₄)، پربورات سدیم (NaSo₄) اشاره داشت.

·     آب اکسیژنه در ترکیب با یون های فلزی و آنزیم ها، آب و گاز اکسیژن تولید می کند. (تولید حباب های گازی) از این ترکیب برای تست کاتالاز مثبت نیز استفاده می شود.

·     پربورات سدیم که تاثیر زیادی بر باکتری می گذارد و بازدارنده است.

·     پرمنگنات پتاسیم که به عنوان یکی از ترکیبات بسیار اکسید کننده، برای درمان زخم ها و جلوگیری از   عفونت های باکتریایی استفاده می شود و در صنایع شیلاتی نیز از این ترکیب برای ضد عفونی کردن آب استفاده می شود.

اسید ها و ترکیبات قلیایی: قدرت ترکیبات اسیدی بستگی زیادی به قدرت تفکیک یونی و مقدار H⁺ دارد و مقدار ترکیبات قلیایی نیز به قدرت تفکیک یونی و مقدار OH^- وابسته است.

فلزات سنگین:

بسیاری از ترکیبات فلزات سنگین می توانند به عنوان عوامل بازدارنده ی میکروارگانیزم ها مطرح شوند، مثل فلز مس (Cu) که از جمله مهم ترین عناصر حیاتی می باشد و در صورتی که مس در مقداری زیاد، با سولفات ترکیب شود می تواند منجر به تولید سولفات مس شده و به عنوان یک ماده ی بازدارنده ی فعالیت   میکروارگانیزم ها مطرح شود، به ویژه در صنایع شیلاتی به عنوان ماده ی ضد عفونی کننده ی آب استخر های پرورش ماهی استفاده می شود. هم چنین می توان از ترکیبات دیگر مانند مالیشیت گرین در دسته ی فلزات سنگین نام برد.

جلسه نهم****24/2/90

*با توجه به بخش اشعه ها در مورد اشعه فرابنفش تبدیل O₂ به O₃ را نیز می توان نام برد که از O₃ می توان به عنوان ضد عفونی کننده نام برد. این عامل از ناپایداری O₃ جریان می یابد.

روش های از بین بردن باکتری:

روش مکانیکی:

مثل خرد کردن که از طریق یک سری گلبول های پلاستیکی و محلول های حاوی باکتری ها صورت می گیرد که در عمل هم زدن شدید (vortex) یا سانتریفیوژ قرار می گیرند و با ایجاد سرعت زیاد و برخورد باکتری ها به هم در ترکیبات کشته می شوند و از طرفی محتویات درون باکتری از قبیل آنزیم ها، پروتیین ها، آنتی بیوتیک ها (نایسین ها) در اثر برخورد گلبول های پلاستیکی به باکتری خارج شده و از طرف دیگر قطعات دیواره ی سلولی که می تواند حاوی مواد تقویت کننده ی سیستم ایمنی باشد مثل گلوکان ها را به راحتی جدا کند.

امواج صوتی:

از طریق دستگاه اولترا ساند (ultra sound) امواج صوتی تولید شده که با برخورد به ذرات هر نوع ذره ای را کشته و از بین می برد و این دستگاه چند مکانیزم عمل دارد:

1.  ایجاد خطرات واکوئل های ریز گازی در داخل باکتری که عامل اختلاف فشار را شامل می شود و با جریان یافتن سریع، سیتوپلاسم باکتری متلاشی می شود.

2.  ایجاد حرارت و تولید H₂O­₂ که یک ترکیب ضد باکتریایی می باشد.

3.  شکسته شدن ماکرومولکول ها

خشک کردن:

اساس آن از دسترس خارج کردن آب برای باکتری است. یعنی فعالیت آبی باکتری را قطع کرده و در نتیجه باکتری را از بین می برد.

فعالیت آبی: هر میکروارگانیزمی برای حداقل فعالیت زیستی خود نیازمند حداقل رطوبتی است که به این رطوبت مورد نیاز فعالیت آبی می گویند. میکروارگانیزم ها برای فعالیت هایشان (متابولیسمی، ترشح سم و ...) به محیطی مرطوب نیاز دارند.

روش های خشک کردن:

1.  نمک سود کردن: به دلیل تمایل زیاد ترکیبات نمکی به جذب رطوبت، موجب حذف رطوبت از محیط شده و فعالیت آبی باکتری را از بین می برد و در نتیجه باکتری از بین می برد.

2.  در معرض آفتاب (Sun Dry): وجود اشعه فرابنفش که عاملی است بر استزیلیزاسیون و از بین رفتن باکتری.

3.  استفاده از حرارت: استفاده از دستگاه های حرارتی (آون و انکوباتور و ...)

4.  حرارت و دودی کردن: ترکیبات ضد باکتریایی موجود در دود باعث می شود تا باکتری ها از بین بروند و دو شکل دودی کردن وجود دارد: 1. سرد    2. گرم

1.  سرد: دود سرد بدون حرارت

2.  گرم: حرارت همراه با دود ناشی از سوختن چوب و ... که رطوبت را کاهش می دهد.

گاهی اوقات دودی کردن موجب فساد نیز می شود که دلیلش تخلیه ی ناصحیح مواد شکمی و درونی موجود و باقی ماندن باکتری ها و رشد دوباره ی آن ها می باشد. مثل باکتری کلسترو بوتولینیوم که از این دست باکتری ها می باشد.

انجماد:

زمانی که دما به صفر می رسد، باکتری های زیادی از بین می روند و تنها تعداد اندکی از باکتری ها در این شرایط دمایی فقط زنده می مانند (بعضی از میکروارگانیزم ها در دمای 196- درجه سانتیگراد نیز زنده         می مانند).

شرایطی که در انجماد برای باکتری به وجود می آید:

1.  باکتریواستات (bacterio stat): برخی از مواد و شرایط که باکتری را از لحاظ فعالیت متوقف می کنند.

2.  باکتریوسیدال (باکتریوسین (bactriosin)): برخی از شرایط که باعث مرگ باکتری می شوند.

تاثیر انجماد بر باکتری:

·     تشکیل کریستال های ریز یخی و از بین رفتن و آسیب دیدن سلول باکتری

·     آب موجود در اطراف باکتری منجمد می شود و سپس رطوبت باکتری نیز منجمد شده و الکترولیت های درون باکتری ها تغلیظ یافته که با بیشتر شدن غلظت، PH تغییر می کند و با ایجاد این عامل ماهیت پروتیین موجود در باکتری نیز تغییر می کند که در نتیجه سلول خواص کاربردی خود را از دست می دهد و موجب مرگ سلول    می شود.

خواص کاربردی پروتیین در باکتری: جذب آب، چربی، تشکیل کف، امولوسیون، نگهداری آب و خواص غذایی، حلالیت

·     نمک، حرارت، اندازه ی باکتری، PH در پروتیین تاثیر می گذارند.

·     به منظور جلوگیری از آسیب سلول باکتری در اثر انجماد از مواد شیمیایی خاص (اتیلن گلایکول، گلیسرول، دی متیل سولفواکساید (DMSO)) استفاده می شود و خنثی سازی جهش باکتری را شامل می شود که مصارف این جلوگیری، نگهداری باکتری برای آزمایشات و ... است.

خشک کردن در شرایط خلا (لیوفیلیزاسیون / انجماد و خشک کردن توام (freeze dry)):

اساس این عمل نگهداری باکتری در دمای 60- تا 90- درجه سانتیگراد و قرار دادن در شرایط خلا می باشد که خلا موجب حذف رطوبت می شود.

جلسه هشتم****18/2/90

پرگنه های باکتری (کلونی های باکتریایی): بعد از رشد میکروارگانیزم ها بر روی محیط کشت جامد، باکتری ها به صورت کلونی هایی که با چشم غیر مسلح قابل رویت است، دیده می شود و گاهی نیز اتفاق می افتد که کلونی ها به قدری ریز هستند که فقط با استفاه از میکروسکوپ قابل مشاهده اند. گاهی بعد از کشت باکتری، سطح محیط کشت کاملا پوشانده می شود که علت این امر قدرت حرکت برخی از میکروارگانیزم هاست که با تحرک خود، در تمام سطح کشت حرکت کرده و محیط را پوشش می دهند.

*برخی از کلونی ها حالت ماهواره ای دارند به این شکل که یک کلونی بزرگ در مرکز قرار دارد و کلونی های ریزی در اطراف آن قرار دارند.

ویژگی های کلونی از لحاظ شکل سطح کلونی: 1- صاف    2- برآمده

کناره های کلونی: 1- دندانه دار   2- صاف و بدون دندانه

رنگ کلونی: از اهمیت زیادی در شناسایی باکتری ها بر خوردار است

قوام کلونی:

1-  بعضی از باکتری ها بدون قوام هستند که شکسته می شوند.

2-  بعضی از باکتری ها با قوام هستند که به راحتی از محیط کشت جدا می شوند.

بر اساس قوام باکتری ها دارای شرایط زیر هستند:

1-  کلونی نرم (smoth): دارای قوام خامه ای و کناره های منظم و شکل هندسی منظمی دارند.

2-  کلونی خشک (rough): دارای قوام خشک و شکل هندسی نا منظم و کناره های نا منظمی دارند.

ویژگی های کلونی: 1- سینرجیستی   2- آنتاگونیستی

1-  سینرجیستی: تقویت و تشدید اثر دو یا چند ماده یا موجود زنده زمانی که در کنار یکدیگر قرار می گیرند. مثل آنتی اکسیدان ها (فرایند پیری به دنبال اکسایش ترکیبات غذایی به ویژه چربی هاست که رادیکال هایی (R^o) ایجاد می کند که مواد آنتی اکسیدانی این فرایند را متوقف می کنند) و هم چنین ویتامین C و E که در نقش تقویت کننده و احیایی را ایفا می کنند.

سینرجیستی در باکتری: برخی باکتری ها به علت توانایی در تولید برخی مواد مثل ویتامین B₁₂ (سیانوکوبالامین) باعث تقویت و تشدید سایر میکروارگانیزم ها می شود.

2-  آنتاگونیستی: تضعیف اثر دو یا چند ماده یا موجود زنده، زمانی که در کنار یکدیگرند. مثل آنتی نوترینت ها (مواد ضد تغذیه ای) که در سویا، پنبه دانه و لوبیا وجود دارند (به طور مثال اگر سویا خام مصرف شود مانع از جذب مواد غذایی می شود و برای از بین بردن این ویژگی از اعمالی مانند حرارت دادن، خیساندن و تغییر PH استفاده می شود).

آنتاگونیستی در باکتری: آنتی بیوتیک ها به دلیل توانایی در ترشح سم و هم چنین نیاسین ها که در این دسته قرار می گیرند.

*در صنایع غذایی سس ماهی و سس سویا دارای این ویژگی اند.

ویژگی تضاد اجرام در کلونی ها: زمانی که در یک محیط غذایی یا محیطی رودوی فلور غالب باکتریایی هضم شود، فرصتی به سایر باکتری ها که کمی حساس ترند داده می شود تا رشد مناسبی از خود نشان دهند.

عومل موثر بر باکتری ها: عوامل مختلف شیمیایی و فیزیکی بر روی باکتری ها تاثیر گذارند.

عوامل فیزیکی:

اشعه دادن: برای ضد عفونی کردن محیط ها می باشد که اشعه ها به دو دسته ی یونیزان و غیر یونیزان تقسیم   می شوند.

اشعه غیر یونیزان: مهم ترین اشعه غیر یونیزان، اشعه فرابنفش می باشد که طیف خاصی از نور خورشید با طول موجی 320-220 nm همراه می باشد و علت اصلی خاصیت ضد عفونی کنندگی نور خورشید می باشد و هر چه طول موج کوتاه تر باشد، قدرت اشعه برای از بین بردن باکتری بیشتر و اشعه تاثیر بیشتری بر روی باکتری   می گذارد.

حداکثر قدرت اشعه فرابنفش در طول موج 260 nm می باشد و میزان عملکرد اشعه فرابنفش بسته به عوامل مختلفی است که عبارتند از: فاصله اشعه، قدرت اشعه، عوامل محیطی (کدورت مهم ترین عامل محیطی         می باشد).

اشعه فرابنفش دارای قدرت نفوذ پایین و سطح عملکرد وسیع است. مثلا در عقیم سازی اسپرم در گونه های مختلف استفاده می شود و هم چنین برای سترون (استریل کردن) محیط های آبی، لوازم ازمایشگاهی، محیط ازمایشگاه استفاده می شود.

اشعه فرابنفش به شدت سرطان زا و خطرناک است و به همین دلیل در زمان استفاده از آن کسی نباید در آزمایشگاه حضور داشته باشد. تاثیری که اشعه فرابنفش بر زنجیره ی DNA دارد، باعث تشکیل دایمر تیمین بر روی زنجیره شده و در نتیجه باعث اختلال ژنتیکی و عدم توانایی در رونویسی از ماده ژنتیکی می شود.

ترمیم در باکتری: دو نوع می باشد، ترمیم وابسته به نور (photo reactivation) و ترمیم بدون نور که      آنزیم های ترمیم کننده ی وابسته به نور فعال می شوند و دایمر تیمین را حذف می کنند.

اشعه یونیزان: مهم ترین اشعه ها اشعه ایکس و گاما می باشند که توسط ژنراتورهای خاصی تولید می شوند و طول موج بسیار کوتاهی دارند.

پرتوتابی این اشعه ها به باکتری باعث تشدید واکنش پذیری میکروبی می شود. این اشعه ها در باکتری ماکرو مولکول ها (نوکلئوئیک یا پروتیین) را تحت تاثیر قرار می دهند و باعث ایجاد شکاف در DNA می شوند. اگر این شکاف در یکی از دو زنجیره باشد، قابل ترمیم است اما اگر در هر دو زنجیره باشد، غیر قابل بازگشت است.

این اشعه ها در برخورد با آب و رطوبت منجر به تشکیل رادیکال هایی می شود که از ایجاد رادیکال ها در آب، OH­^o و  HO^o₂ (ترکیبات اکسید کننده) تشکیل شده که به این مواد پراکساید (اکسایار) گفته می شود. از این    اشعه ها در صنعت برای ضد عفونی کردن لوازم آزمایشگاهی در مقدار زیاد و هم چنین در عقیم سازی گونه های ماده برای ایجاد جمعیت نر استفاده می شود.

روش های کشت باکتری

آزمایش: روش های کشت باکتری

هدف: تفهیم روش ها، مراحل کشت باکتری و بررسی رشد آن ها

به نام آفریننده ی آفرینش

مقدمه:

محیط کشت:

از آن جا که میکروب یک موجود تک سلولی بوده و قادر است کلیه اعمال حیاتی خود را مستقلا انجام دهد بدون آن که نیاز به سلول دیگری داشته باشد. این اصل بیانگر آن است که میکروب ها هم احتیاج به غذا و آب و مواد آلی و معدنی دارند. محیطی مغذی که حاوی کلیه احتیاجات یک میکروب اعم از مواد غذایی و عناصر و غیره باشد که موجب رشد آن میکروب شود را اصطلاحا محیط کشت می گویند.

این محیط کشت می تواند به صورت دست ساز بوده یا به طور طبیعی یعنی داخل سلول های بدن یک جانور باشد.

میکروب ها را می توان بر روی محیط ها و در ظروف مختلف کشت داد که انتخاب شکل بستگی به نوع کشت دارد. مثلا در کشت هایی که محیط آن مایع است ظروف کشت لوله ای می باشد و محیط های جامد (آگاردار) هم در پلیت و هم در لوله کشت داده می شوند.

کشت سطحی :

در این نوع کشت هم از محیط پیش ریخته استفاده می شود. این روش کشت بیشتر برای محیط های مایع میکروبی کاربرد دارد و یا اگر محیط مایعی مانند شیر مشکوک به آلودگی میکروبی باشد آن را می توان به این روش کشت میکروبی داده و میکروارگانیزم های موجود در آن را مشخص نمود.

برای این کار ابتدا یک رقت معینی از محیط مایع تهیه نمایید. سپس با استفاده از پیپت استریل مقدار مشخصی از آن رقت را برداشته و در سطح محیط جامد پیش ریخته توسط میله پخش کننده یا توک آنس پخش نمایید و بعد از انکوباسیون می توانید کلونی های رشد یافته در سطح محیط کشت را مشاهده کنید توجه داشته باشید که هنگام انجام کشت سطحی باید سطح محیط خشک باشد .

چون هنگام ریختن محیط کشت به صورت پیش ریخته ممکن است بخار آب روی درب پلیت و سطح محیط جمع شود و برای خشک کردن آن می توان محیط ها را در یک گرم خانه با دمای 50-25 درجه قرار داده و خشک نمود. به این ترتیب که درب پلیت را برداشته و قسمت محتوی محیط کشت را وارونه روی لبه درب قرار دهید تا قطرات رطوبت حذف گردد.

هم چنین می توانید پس از ریختن محیط کشت در پلیت در صورت تجمع حباب هوا ، آن ها را با شعله دادن سطح محیط حذف نمایید. این کار باعث سترون شدن سطح محیط کشت هم می شود.

کشت آمیخته یا پورپلیت:

در این روش کشت هم نیاز به تهیه سوسپانسیون از باکتری می باشد. یعنی باید از باکتری مورد نظر در محیط مایع رقت معینی را تهیه نموده بعد به میزان 1 سی سی از آن را در کف پلیت استریل ریخته سپس از محیط کشت مورد نظر که قبلا استریل شده و حرارت آن به حدود 45 درجه سانتیگراد رسیده به میزان 15-20 سی سی به پلیت اضافه نمایید. سپس با حرکات دورانی بصورت عدد 8 انگلیسی آن را کاملا مخلوط کنید. اگر نیاز بود مجددا سطح محیط آمیخته با باکتری را با یک لایه نازکی از همان محیط کشت بپوشانید، دراین حالت به آن کشت دولایه هم گفته می شود.

گزارش:

در بررسی انواع روش های کشت در هفته ی گذشته به بررسی روش های کشت در محیط کشت مایع و برای جامد کشت عمقی، خطی و سطح شیبدار را انجام داده ایم و حال در این هفته به بررسی روش های کشت سطحی و پورپلیت می پردازیم.

ابتدا عمل رقیق سازی را بر روی نمونه ی مورد آزمایش (نوشابه) انجام می دهیم و تا رقت 10^-3 را تهیه می کنیم. سپس برای کشت سطحی یک پلیت محیط کشت پیش ساخته (EMB) را برداشته و از رقت 10^-3 تهیه شده، با استفاده از پیپت یک میلی لیتر روی محیط کشت حاضر می ریزیم و با استفاده از میله شیشه ای سر کج آن را پخش می کنیم و در انکوباتور قرار می دهیم.

برای کشت پور پلیت نیز ابتدا یک تا دو میلی لیتر از رقت تهیه شده ی 10^-3 را با استفاده از پیپت در کف پلیت استریل می ریزیم و سپس به صورت چشمی 20 تا 25 میلی لیتر محیط کشت (PCA) را به آن اضافه می کنیم و در مرحله ی بعد به صورت عدد 8 انگلیسی دوران می دهیم و می گذاریم تا محیط کشت ببندد و در انکوباتور قرار می دهیم.

·     در انجام آماده سازی محیط کشت و رقیق سازی موارد اصولی فراموش نشود.

·     در انجام آزمایشات بر روی محیط کشت جامد سعی شود تا زمان کار بر روی محیط کشت به محیط آسیبی نرسد.

·     شرایط انکوباتور برای کشت زمان 72 ساعت و دمای 37 درجه ی سانتی گراد می باشد.

·     توجه داشته باشید که این آزمایش را نیز مانند تمام آزمایشات در شرایط استریل و در کنار شعله انجام می شود.

نتیجه:

کشت سطحی: یک کلونی بزرگ به شکل نامنظم و دارای سطح برآمده در نمونه دیده می شود.

کشت پورپلیت: حداکثر30 کلونی به شکل کروی و دارای شکلی منظم در محیط کشت رشد یافته اند.

خطای آزمایش:

در کشت سطحی به دلیل برگرداندن سریع محیط کشت پس از ریختن رقت مقداری از آن خارج شده و دلیل رشد نیافتن درست کلونی ها بر روی محیط کشت نیز همین می باشد و هم چنین در کشت پورپلیت به دلیل ریختن رقتی بیش از حد مایع معلق در محیط کشت دیده می شود.

استفاده از لوازم استریل نیافته نیز عاملی بر کشت نادرست باکتری ها می باشد.

منبع:

 www.azmayeshat.mihanblog.com   

اهالی خانه حاجی 3

اهالی خانه حاجی 2

جلسه هفتم****4/2/90

روش شمارش باکتری و انواع باکتری و مراحل رشد باکتری

روش شمارش بیشترین تعداد احتمالی: این روش یکی از بهترین روش هاست و یکی از روش های کاربردی در صنایع غذایی حساس مثل لبنیات (شیر) می باشد و معمولا برای شمارش میکروارگانیزم هایی که تعدادشان کم تر از 10cfu باشد، استفاده می شود و این روش بر اساس میکروارگانیزم هایی که به صورت یکنواخت پراکنش دارند می باشد. (پراکنش برای اندازه گیری مهم است) در این روش تعداد مراحل نمونه گیری تکرار می شود. مثال:

سه مرحله نمونه گیری با رقت های مختلف: 10⁴ و 10⁵ و 10⁶ که با استفاده از لگاریتم عدد نهایی حاصل می شود. و خطا نیز از طریق انحراف معیار محاسبه می شود.

در صورت کم بودن تعداد میروارگانیزم ها از دو روش برای شمارش استفاده می شود:

1- روش مستقیم    2- روش غیر مستقیم

روش مستقیم: استفاده از میکروسکوپ

روش غیر مستقیم: استفاده از عوامل ایجاد شده

1- کدورت: رشد میکروارگانیزم ها همراه با کدر شدن ماده ی غذایی است.

2- تولید گاز: از حباب های گازی تشکیل شده استفاده می شود.

3- تولید اسید و باز (تغییر PH): همراه با تغییر رنگ باکتری است.

4- ترکیبات احیایی: ترکیبات رنگی (متیلن بلو، روزازورین، فنیل ترازولیوم کلراید) که به دلیل تمایل زیاد   باکتری ها به جذب الکترون که تغییر رنگ را شامل می شود.

انواع باکتری از لحاظ نیاز به اکسیژن:

1- هوازی اجباری: بر روی سطح ماده موجود در ظرف

2- بی هوازی اجباری: در انتهای ماده موجود در ظرف 

3- بی هوازی اختیاری: در تمام نقاط ماده موجود در ظرف

4- میکرو آئروفیل: در زیر سطح ماده موجود در ظرف

انواع باکتری از لحاظ دمایی:

نوع باکتری	دمای رشد (درجه سانتی گراد)	اکتیمم (دمای بهینه رشد) (درجه سانتی گراد)
سرما دوست	20-0	12-7
سرما گرا	30-0	17-10
مزوفیل	45-20	37-25
ترموفیل	75-45	50
هایپر ترموفیل	بیش از 100	-

ترمودیوریک: این دسته از باکتری ها در دمای بالا فقط زنده می مانند و قادر به رشد و تکثیر نیستند.

هالوفیل (نمک دوست): در مقدار بالای نمک، رشد و تکثیر و زندگی می کنند.

هالو دیوریک: در مقدار بالای نمک فقط زنده می مانند و قادر به رشد نیستند.

اسموفیل (قند دوست): در مقدار بالای قند، رشد و تکثیر و زندگی می کنند.

اسمو دیوریک: در مقدار بالای قند فقط زنده می مانند و قادر به رشد نیستند.

مراحل رشد باکتری:

a: مرحله فاز تاخیری (lag phase): در این مرحله هیچ گونه رشدی وجود ندارد، از چند ساعت تا چندین ساعت به طول می انجامد، از دلایل طولانی شدن این فاز، تعداد کم باکتری ها و عدم سازگاری با محیط کشت و استفاده از محیط های کشت قدیمی و نامساعد بودن شرایط می باشد و هر چه شرایط مساعدتر باشد، زمان این فاز کاهش می یابد. در این مرحله یک سری واکنش های بیو شیمیایی اتفاق می افتد که نتیجه ی آن، افزایش سازگاری با محیط کشت می باشد و هم چنین اگر هر چه میکروارگانیزم ها در مرحله ی b به محیط کشت جدید، منتقل شوند، فاقد فاز تاخیری خواهند بود.

b: مرحله فاز رشد انفجاری (accelerating phase): این مرحله به دنبال فاز تاخیری است. در این مرحله باکتری خود را به شرایط جدید سازش (سازگاری:adaptation) و شروع به رشد سریع در محیط کشت می کند.

c: فاز رشد لگاریتمی (log phase): یکی از مهم ترین مراحل رشد می باشد، در این مرحله تعداد باکتری ها در واحد زمان دو برابر می شود و به سرعت جمعیت باکتری ها افزایش می یابد و بیشترین میزان تولید   متابولیت ها (آنزیم ها، آنتی بیوتیک ها) در این مرحله می باشد و همواره صنایع تولیدی فراورده های باکتریایی به دنبال این فاز می باشند.

d: مرحله ی سکون (stationary phase): بعد از نامساعد شدن شرایط، کم شدن مواد مغذی، به هم خوردن تعادل PH، ترشح متابولیت های سمی، فاز رشد لگاریتمی به مرحله ی سکون می رسد که در این مرحله تعداد باکتری های مرده و متولد شده، برابر است. هرچه مقدار پروتیین در باکتری ها، سریع تر کاهش یابد، باکتری   زود تر به مرحله ی سکون می رسد و باکتری هایی که دارای رشد سریعتری هستند، نسبت به آنزیم ها و مواد شیمیایی حساس ترند (باکتری ها در مرحله فاز رشد نمایی نسبت به فاز تاخیری حساسیت بیشتری دارند).

e: مرحله ی مرگ (death phase): در این مرحله آهنگ رشد کم شده و هیچ وقت به صفر نمی رسد (مثل باکتری vibrio که در این مرحله یک سال و باکتری سودزموناس که 14 سال زنده می مانند). در این مرحله باکتری های مولد اسپور قادر به تولید اسپور هستند و باکتری هایی که قادر به تولید اسپور نیستند به صورت کامل از بین نمی روند.

جلسه ششم****28/1/90

اندازه گیری اندازه ی یک باکتری برای بررسی رشد آن و شمارش باکتری

اندازه گیری اندازه ی یک باکتری برای بررسی رشد آن:

روش اول: ابتدا باکتری را بر روی لام آزمایشگاهی قرار داده و با استفاده از میکروسکوپ سیاه از آن عکس تهیه کرده و با بزرگنمایی حجم آن را بدست می آوریم.

روش بیومس (زی توده-biomass): استفاده از کل توده ی زیستی که برای اندازه گیری اقدام به استفاده از تعیین میزان کربن می کنیم.

روش تعیین میزان ماده ی خشک: با بررسی ترکیبات شیمیایی (proximate compozitoin) موجود از قبیل: خاکستر (ash)، پروتیین (protein)، چربی (fat)، رطوبت (moisture).

در این روش خاکستر از بقایای مواد معدنی است و هم چنین در رطوبت پس از خشک کردن، ماده ی خشک باقی می ماند که اگر این مقدار متغیر باشد در میزان رشد باکتری نیز تغییر ایجاد می کند. (مطابق با تغییر)

*با حذف رطوبت پروتیین اضافه می شود.

روش تعیین از طریق افزایش حجم: با افزایش حجم، DNA ثابت است و سیتوپلاسم افزایش یافته و در نتیجه RNA نیز افزایش می یابد و هم چنین با افزایش تعداد و رشد، هم DNA و هم RNA افزایش می یابند که در این روش از طریق سنجش میزان RNA نسبت به DNA، رشد را تعیین می کنند.

*اگر مقدار RNA بیش از حجم مجاز شود، برای انسان آلرژیک می شود.

شمارش باکتری:

شمارش باکتری از دو طریق انجام می پذیرد: شمارش باکتری های زنده- شمارش باکتری های زنده و مرده

شمارش باکتری های زنده:

روش شمارش صفحه ای: (pour plate count): از دقیق ترین و استاندارد ترین روش ها می باشد که در تعیین کیفیت بهداشتی مواد غذایی استفاده می شود. این روش مشکلاتی نیز به همراه دارد که عبارتند از: عدم توانایی در سنجش میکروارگانیزم های سرما دوست و سرما گرا و هم چنین عدم توانایی در سنجش میکروارگانیزم های غذاهای تخمیری.

در این روش ابتدا رقت های خاصی تعیین می شود (با توجه به دید اولیه ای که نسبت به باکتری های مواد غذایی وجود دارد و هم چنین در صورت عدم وجود دانش کافی علتی است بر این که چندین رقت تهیه شود)(مثلا در یک ماهی برای گوشت آن رقت های 10²-10⁷ تهیه می شود) بعد از تهیه رقت ها محیط کشت در داخل لوله های آزمایش یخته شده و در داخل آب جوش قرار می گیرد. در همین حال رقت های تعیین شده در پلیت قرار می گیرند و سپس محیط کشت از حرارت بالا خارج شده و تا دمای 40-45 درجه سانتی گراد سرد می شود. بعد از سرد شدن، محیط کشت به پلیت اضافه می شود و در انکوباتور به مدت 48 تا 72 ساعت قرار می گیرد و هم چنین دمای 32 تا 37 درجه سانتی گراد. (با این روش تنها باکتری های هوازی مزوفیل مورد بررسی قرار می گیرند) پس از ایجاد کلونی ها برای شمارش از لام هماسیتومتر (hemacytometer) استفاده می شود.

شمارش باکتری های زنده و مرده: این روش جهت شمارش باکتری های زنده و مرده صورت می گیرد و این عمل از طریق میکروسکوپ می باشد که پس از تهیه ی گسترش باکتریایی و عمل رنگ آمیزی، تعداد میکروب ها در زیر میکروسکوپ شمارش می شود.

روش کدورت سنجی: این روش جهت سنجش تعداد باکتری ها در محیط کشت مایع انجام می شود که در این روش سانتریفیوژ یا شستشوی قبل از انجام مراحل، لازم می باشد.

این روش خود به دو روش مجزا تقسیم می شود: 1- اسپکتروفتومتر   2- لوله های مک فارلند

1-      اسپکترومتر: این روش با استفاده از دستگاهی با همین نام انجام می شود که بر اساس بررسی اختلاف طول موج تابیده شده به ماده و طول موج خارج شده از سلول و مطابقت با یک نمونه محلول شاهد (blank) تعداد باکتری ها را تعیین می کند.

2-      لوله های مک فارلند (Mc farland): از نمک باریم برای ساختن لوله های مک فارلند استفاده می شود و پس از تهیه غلظت های مختلف این نمک، لوله هایی با کدورت های مختلف ایجاد می شود که با مقایسه ی     نمونه ی آزمایشگاهی و نمونه های استاندارد و بررسی جدول استاندارد موجود، تعداد باکتری ها مشخص می شود.